利用液体活检揭示cfDNA甲基化实现肿瘤的精准分型与动态监测新突破
2025-12-24 来源:本站 点击次数:294来自美国得克萨斯大学MD安德森癌症中心的John V. Heymach与Lauren A. Byers等团队合作，通过纳入179名小细胞肺癌（SCLC）患者的两个独立临床队列，采用前瞻性设计的FFPE-RBS和cfDNA-RBS技术，系统绘制了SCLC转录亚型的DNA甲基化图谱，成功开发了一种高度准确的DNA甲基化分类器（SCLC-DMC），实现了从肿瘤组织和血浆样本中同时鉴定四种SCLC亚型（SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P和SCLC-I）。相关研究成果以“Tumor- and circulating-free DNA methylation identifies clinically relevant small cell lung cancer subtypes“为题发表于《Cancer Cell》期刊。
该研究作为一项小细胞肺癌（SCLC）分子分型的突破性成果，首次利用纵向液体活检证实，SCLC肿瘤表型在疾病进展和治疗过程中存在动态变化，尤其是鉴定出SCLC-A向炎症型SCLC-I亚型转换，揭示了cfDNA甲基化在临床治疗全周期持续监测SCLC分子亚型的重要价值。该研究以cfDNA甲基化建立SCLC精准分型的新型生物标志物体系，为克服传统组织活检样本稀缺、片段降解等技术瓶颈提供了创新解决方案，推动了SCLC个性化治疗的临床应用前景。
英文标题：Tumor- and circulating-free DNA methylation identifies clinically relevant small cell lung cancer subtypes
中文标题：ctDNA和cfDNA DNA甲基化可鉴定临床相关的小细胞肺癌亚型
发表时间：2024年
发表期刊：Cancer Cell
影响因子：IF44.5/Q1
技术平台：RNA-seq、FFPE-RBS、cfDNA-RBS
作者单位：MD安德森癌症中心
DOI:10.1016/j.ccell.2024.01.001
小细胞肺癌（SCLC）是一种存在不同转录亚型的侵袭性恶性肿瘤，但由于SCLC组织样本的稀缺性，其在临床中精准分型仍面临挑战。此前研究结果表明，SCLC关键转录程序主要受表观遗传调控，本研究发现在SCLC患者的肿瘤组织或血液样本中可检测到不同亚型的特异性DNA甲基化模式。具体而言，通过对179名SCLC患者的两个队列进行DNA甲基化测序分析（FFPE-RBS和cfDNA-RBS），并采用机器学习方法开发出DNA甲基化分类器（SCLC-DMC），能够准确区分SCLC亚型。
研究进一步研究利用该分类器对血浆cfDNA以进行SCLC亚型分型，发现SCLC表型在疾病进展过程中发生变化，表明在临床治疗方案中对SCLC进行纵向追踪的必要性。这些数据充分证实，肿瘤和cfDNA甲基化可用于鉴定SCLC亚型，并可能指导SCLC的精准治疗。
研究亮点
- 小细胞肺癌亚型可通过RNA-seq测序和预测模型进行评估
- cfDNA-RBS小细胞肺癌亚型具有亚型特异性DNA甲基化谱
- DNA甲基化可以从组织活检和液体活检中进行亚型分型
- 液体活检为患者亚型诊断提供了一种无创替代方案
图形摘要
研究方法
队列及样本：
研究纳入两个独立队列共179名SCLC患者，收集其FFPE肿瘤组织和匹配的血浆样本。
分子机制分析：
- RNA测序（RNA-seq）：对142个肿瘤样本进行RNA-seq，使用SCLC-GRC基因比率分类器作为“金标准”定义SCLC的四种亚型（SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P和SCLC-I）。
- 简化基因组甲基化测序（cfDNA-RBS和FFPE-RBS）：对124个FFPE肿瘤组织样本和54个血浆cfDNA样本进行DNA甲基化分析。
- 超低深度全基因组测序（ULP-WGS）：评估血浆样本中的ctDNA分数。
机器学习与模型构建：
- DNA甲基化分类器开发：整合肿瘤组织和细胞系的RRBS数据。通过受试者工作特征曲线（ROC）分析，筛选出与每个SCLC亚型高度相关（AUC>0.8）的差异化甲基化位点。
- 模型构建：使用极限梯度提升（XGBoost）机器学习算法，训练了500个模型，并通过共识策略（≥50%模型一致）对样本进行亚型分类，由此构建了SCLC-DMC（组织）和cfDMC（血浆）。
数据分析：
比较不同亚型间的全基因组甲基化模式、差异表达基因（表观遗传调控酶），并分析亚型与药物敏感性（体外细胞系数据）及患者总生存期（OS）的相关性。
结果图形
（1）血浆DNA甲基化检测SCLC
研究首先验证了cfDNA甲基化检测在SCLC早筛早诊中的可行性。他们使用了一个包含6个肺癌特异性甲基化标记物的PCR商业检测方法对52例SCLC患者和398例对照的血浆cfDNA甲基化进行分析。
结果显示，该检测方法区分SCLC患者与对照的曲线下面积（AUC）高达0.988，具有极高的灵敏度和特异性（图1A）。这表明基于cfDNA甲基化的检测方法能够高精度地识别SCLC存在，为后续基于cfDNA进行亚型分型奠定了基础。
图1：SCLC的检测与分类
（2）临床标本队列的RNA-seq与DNA甲基化分析队列
研究建立了两个独立的患者队列（C1和C2），共179名SCLC患者，旨在同步获取RNA表达谱和DNA甲基化谱数据。排除RNA或DNA质量或数量不足的样本后，研究最终对142个样本进行了RNA-seq，对124个组织样本进行了RRBS甲基化分析，并对54个血浆样本进行了cfDNA-RBS分析（表1）。这个精心设计的、配对的多组学队列是后续开发并验证甲基化分类器的关键资源。
在15/74份样本（21%）无法进行RRBS。排除这些样本后，C2的RRBS成功率为72%（41/57），整个数据集的成功率为76%（124/164）。
(3) 基于简化机器学习RNA-seq特征对临床SCLC进行分类
为建立一个适用于单个样本且更实用的分型工具，研究者在之前非负矩阵分解（NMF）分型的基础上，开发了一个基于181个基因比率的分类器（SCLC-GRC）。该分类器通过整合500个机器学习模型的共识，能够以96%的成功率（136/142）将样本明确分为四种亚型，其亚型分布与大型临床试验（IMpower133）中的比例相似（图1B）。该GRC分类器被用作后续DNA甲基化分类器性能评估的基准。
（4）SCLC-P的全基因组低甲基化特征
通过分析全基因组DNA甲基化模式，研究者发现不同SCLC亚型具有特异性甲基化图谱。最显著的表观遗传差异是，SCLC-P亚型在肿瘤组织中表现出全基因组范围的低甲基化（hypomethylation），而SCLC-N则呈现高甲基化状态，SCLC-A和SCLC-I介于两者之间（图2A）。有趣的是，这种模式在SCLC细胞系中发生了逆转（SCLC-P细胞系反而高甲基化），提示肿瘤微环境可能影响全局甲基化状态。进一步分析发现，与DNA和组蛋白甲基化酶（如DNMT1/3A/3B, MAT2A, SUV39H1）在不同亚型之间存在差异表达（图2B-F），特别是SUV39H1-DNMT3A/B轴可能参与不同亚型甲基化差异调控（图2G）。通过ROC分析，研究者鉴定出大量与不同亚型特异性相关（AUC > 0.8）的100 bp基因组区域（图2H-L），这些区域为构建甲基化分类器提供了候选标志物。
图2：小细胞肺癌中亚型特异性的DNA甲基化
RRBS进行DNA甲基化分析，并在C1肿瘤样本中以100kbp为窗口对每个样本和亚型的DNA甲基化进行平均，突出显示500 bins（=50mbp）的滚动平均值。
(B-G) 对每个SCLC亚型的基因表达进行分析，包括DNA甲基转移酶1（DNMT1；B）、DNA甲基转移酶3A（DNMT3A；C）和3B（DNMT3B；D）、甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A；E）以及组蛋白赖氨酸甲基转移酶（SUV39H1；F）。（G）SUV39H1表达与组蛋白甲基化关联的机制。
(H) 示意图突出显示使用100bp窗口与每个SCLC亚型相关的DNA甲基化位点的分析和筛选过程。
(I–L) 展示了SCLC-A（I）、SCLC-N（J）、SCLC-P（K）和SCLC-I（L）在各染色体上的DNA甲基化窗口及其在基因组中的位置，并注明了每个亚型的区域数量。
（5）DNA甲基化可用于SCLC标本分类
基于上述发现的亚型特异性甲基化差异，研究者开发了SCLC-DNA甲基化分类器（SCLC-DMC），将数据分为训练集和测试集，筛选出与各亚型高度相关的甲基化位点并构建模型。在独立测试集上，SCLC-DMC的分类准确率达到95.8%，与RNA-based的GRC分类器高度一致（图3B）。更重要的是，SCLC-DMC成功对30个丢失RNA-seq数据的样本进行准确分型，证明了其在RNA分析失败情况下的应用价值。该分类器在SCLC细胞系中也表现出高准确度（96.6%）。
图3：基于DNA甲基化的SCLC亚型
（6）DNA甲基化在ctDNA中得以保留，并可用于SCLC亚型分类
研究团队首先利用ULP-WGS和7个线性相关CpG位点的甲基化水平（R=0.89, p<0.0001），建立了cfDNA中ctDNA比例的便捷评估方法（图3C），发现基线样本与进展期样本ctDNA负荷无显著差异（图3D），证实疾病全程均可实施液体活检。比较配对肿瘤组织与血浆甲基化图谱显示，SCLC特异性甲基化模式在cfDNA中得以保留（图3E）。基于此，研究团队使用与组织SCLC-DMC相同的甲基化位点（经cfDNA检测灵敏度过滤），专门为cfDNA数据调整并训练了新的cfDMC分类器，该cfDMC在血浆样本中实现了与组织GRC分型100%一致（43/43）（图3F），与组织DMC分型93.3%一致。更具临床价值的是，对匹配的基线-进展期血浆样本的纵向分析揭示，部分（13例）SCLC-A患者在治疗后出现向SCLC-I的亚型转换（图3G），其免疫相关基因（CXCL12、CIITA、STAT1及干扰素受体）启动子甲基化显著降低，伴随炎症表型觉醒。这种动态监测能力是传统组织活检无法实现的，cfDNA-RBS的微创特性使重复采样成为可能，为捕捉治疗诱导的肿瘤演化提供了可行途径。
（7）DNA甲基化预测药物反应和临床结局的能力与基因表达相似
为验证甲基化分型的生物学和临床相关性，研究者进行了两方面分析。
首先，在SCLC细胞系中，基于甲基化分型（SCLC-DMC）定义的亚型，能够复现出基于基因表达分型已知的药物敏感性差异。例如，SCLC-N细胞系对CDK抑制剂R-547和Aurora激酶抑制剂CYC-116更敏感（图4A-B）。
其次，在患者队列中，基于DNA甲基化（SCLC-DMC）分型得到的SCLC-A和SCLC-N亚型患者，其总生存期（OS）与基于RNA（SCLC-GRC）分型得到的结果没有显著差异（图4C-D）。这表明DNA甲基化分类器不仅能在技术上准确分型，还能反映与基因表达分型相似的预后信息，具有临床实用性。
图4：SCLC分型方法对体外药物筛选和临床结局的作用
结论和启示
本研究成功开发了基于组织和cfDNA甲基化的SCLC亚型分类器，且揭示了SCLC的特异性DNA甲基化特征存在于肿瘤组织和血液游离细胞中，可通过液体活检进行检测，从而实现微创、准确的分子分型和疾病进展监测。
cfDNA-RBS在本研究中扮演了核心技术作用，通过限制性酶切富集基因组中CpG密集区域（如启动子、增强子），在保证全基因组覆盖度的同时，大幅降低了测序成本和数据量，特别适用于cfDNA这种DNA总量少、片段化的样本。利用cfDNA-RBS获得的甲基化谱，能够高度还原肿瘤组织的表观遗传特征，从而从“液体活检”中获取与组织活检一致的分子分型信息。
参考文献：
Heeke S, …, Byers LA, Heymach JV,et al. Tumor- and circulating-free DNA methylation identifies clinically relevant small cell lung cancer subtypes. Cancer Cell. 2024 Jan 24. doi: 10.1016/j.ccell.2024.01.001.
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