文献信息

四川大学华西医院神经内科、四川大学华西医院放射科、四川大学华西医院康复医学中心等团队的研究成果“Pulsed electromagnetic fields mediate sensory nerve regulation for bone formation in aging models”（脉冲电磁场介导衰老模型中骨形成的感觉神经调节）在学术期刊《Nature Communications》（IF=15.7）上发表。平生公司的小动物离活一体Micro CT（型号：NEMO）产品在论文中提供了重要的小鼠骨骼CT图像和定量分析。

该研究系统阐明脉冲电磁场抑制骨流失的机制，并创新性揭示Sema3A促进骨形成的新的下游信号轴，为神经-骨交互研究提供了关键证据。

该研究的通讯作者为洪桢教授。第一作者为王田田副研究员。

文献摘要
骨质疏松症的核心病理是成骨-破骨耦合失衡，而衰老骨髓微环境呈“促脂肪-抑成骨”倾向。脉冲电磁场（PEMF）作为无创、安全的物理疗法，临床已用于骨折延迟愈合和骨质疏松，但其促骨形成的分子机制始终未明。近年发现骨为高度神经支配器官，感觉神经肽（CGRP等）可调控间充质干细胞（MSC）命运，提示“神经-骨偶联”可能介导物理刺激效应。本研究旨在回答：PEMF 是否及如何通过感觉神经重塑衰老骨髓微环境，从而逆转骨质疏松表型。作者提出：PEMF 首先激活骨内感觉神经，使其分泌轴突导向分子 Sema3A；Sema3A 通过 MSC 表面受体 Nrp1/PlexinA1，抑制细胞衰老、阻断成脂分化，并驱动 LepR⁺ MSC 向成骨系定向，从而恢复老化骨中“成骨-成脂”平衡。该假设解决了领域内三大关键问题：明确 PEMF 的“第一响应细胞”是感觉神经而非成骨或破骨细胞；揭示 Sema3A-Nrp1 为神经-MSC 对话的核心分子开关；阐明衰老微环境中 MSC 衰老可被物理刺激-Sema3A 信号逆转，为“促骨形成”而非单纯“抑制骨吸收”提供新策略。

脉冲电磁场（PEMFs）可以促进骨形成以对抗骨质疏松症，但其在衰老过程中促进骨健康的机制尚不清楚。本研究表明，PEMFs可以促进衰老雄性小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的新骨形成和神经支配，促进成骨，减少脂肪生成。在该模型中，感觉神经功能障碍会削弱PEMFs诱导的成骨。从机制上讲，PEMF刺激感觉神经分泌脑信号蛋白3A（Sema3A），并且耗尽这些神经或敲除Sema3A消除了PEMF的骨形成作用。Sema3A与表达瘦素受体的MSC中的神经纤毛蛋白-1（Nrp1）相互作用，在衰老的雄性小鼠中帮助骨生成和抑制脂肪生成。“Sema3A-Nrp1”途径的激活对于PEMF对MSC的抗衰老作用是重要的，敲除表达瘦素受体的MSC中的Nrp1会抵消PEMFs的益处。总的来说，PEMFs刺激感觉神经产生Sema3A，促进骨生成，抑制脂肪生成，并对抗MSC衰老。这强调了它们在治疗老年男性骨质疏松症方面的治疗潜力。

实验方法
PEMF治疗
脉冲电磁场组小鼠暴露于脉冲电磁场4周，参数设定为频率8 Hz，强度3.8mT，暴露时间1 h/d，信号发生器产生脉冲猝发波形（突发宽度为62.5 ms;脉冲宽度62.5ms）以8Hz重复，维持3.8 mT的强度和50%的占空比。波形为方形。这些干预参数是基于作者以前的研究，这证明了它们在促进成骨方面的有效性。在PEMF暴露期间使用外部红外温度计，以确认暴露区域的环境温度在整个过程中保持稳定在24±2℃。此外，暴露持续时间和PEMF参数与先前报告无显著热效应的研究一致。

对于安慰剂PEMF组，假手术组的小鼠在暴露室中保持相同的持续时间，没有任何输出。在PEMF干预后，小鼠返回它们的房屋。对于体外PEMF治疗，在细胞培养箱中设置单独的磁场装置，参数为8 Hz，3.8 mT，每天暴露3小时。在体外和体内实验中，使用高斯计监测线圈内的磁场强度，确保每次处理设备的稳定性。

Micro-CT分析
通过Micro-CT评估左侧股骨远端（NMC-100，平生医疗科技有限公司），具有以下参数：70 kV，114 mA和700 ms积分时间。连续获得100幅显微CT图像，层间距为10 μm，感兴趣区设置在长骨组织远端生长板0.6 ~ 1.5mm范围内，重建结束时用Avatar软件（平生医疗科技有限公司）重建完整的股骨干骺端三维结构骨小梁的感兴趣区域从远端干骺端生长板近端股骨长度的5%开始绘制，并向近端延伸股骨总长度的另外5%。从3D分析数据收集以下骨小梁参数：Tb.BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp。

实验结果
PEMFs保护老年小鼠的骨量
为了研究PEMF对骨形成的影响，用PEMF处理年轻（4月龄）和老年（20月龄）雄性小鼠（图1a）。微型计算机断层扫描股骨松质骨的（微CT）分析如图1b所示。PEMF导致股骨松质骨体积分数（BV/TV）显著增加（图1c），骨小梁数量（Tb.N）（图1d）和骨小梁厚度（Tb.Th）（图1 e），以及小梁分离减少（Tb.Sp）（图1f），与假手术组相比，在老年小鼠中，而在年轻小鼠中没有观察到这种作用。

图1 4月龄和20月龄的C57BL/6雄性小鼠用或不用PEMF处理4周。b股骨远端松质骨的代表性显微CT图像。c-f小梁松质骨体积分数（BV/TV）的定量，小梁松质骨数量（Tb. N），松质骨小梁厚度（Tb. Th）和小梁松质骨分离（Tb. Sp），n = 5。

PEMFs通过感觉神经支配促进骨形成
为了研究感觉神经是否参与PEMF诱导的骨形成促进，作者通过将Advillin-Cre小鼠与iDTR野生型（iDTR WT; iDTR^wt）小鼠杂交，在iDTR_Avil−/−小鼠中建立了可诱导的感觉去神经。发现每周三次给予1μg/kg白喉毒素（DTX），持续四周，可以有效诱导成年小鼠的感觉去神经，这种治疗导致CGRP表达减少，而PGP9.5的水平保持稳定。这表明在iDTR_Avil−/−小鼠中观察到的去神经支配主要影响CGRP阳性纤维，而不影响其他感觉神经元。与这些发现一致，与iDTR_Avil−/−小鼠相比，20月龄的老龄雄性iDTR_Avil−/−小鼠也表现出CGRP阳性感觉神经纤维数量减少。关于骨体积参数，作者发现，与iDTR^wt小鼠相比，20月龄雄性iDTR_Avilfl/−小鼠显示BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著降低，Tb.Sp显著增加（图2a、c-f）。

图2 在PEMF诱导的骨形成中需要感觉神经支配。20月龄的雄性Adville-Cre：：iDTR（iDTR_Avifl/-）小鼠和iDTR^wt小鼠接受强度为3.8 mT、频率为8 Hz的PEMF处理1小时，或不进行处理，持续4周。a股骨远端松质骨的代表性显微CT图像。c-f骨小梁松质骨体积分数（BV/TV）的定量，骨小梁松质骨数量（Tb.N），松质骨小梁厚度（Tb.Th）和小梁松质骨分离（Tb.Sp），每组n = 5。

感觉神经中Sema3a的缺失阻断了PEMFs对骨形成的作用
CGRP的免疫染色显示用PEMF处理的老年Sema 3awt小鼠中感觉神经纤维的数量显著增加。相反，在PEMF处理后的Sema 3a KO小鼠中没有观察到这种变化（图4a）。尽管PEMF导致Sema 3awt老年小鼠中BV/TV、Tb.N和Tb.Th的显著增加，但在Sema 3a KO小鼠中没有观察到显著变化（图4 b，e-g）。

图4 将20月龄的雄性Adville-Cre：：Sema 3a（Sema 3a_Avifl/-）小鼠和Sema3a flox/flox（Sema3a^wt）小鼠用强度为3.8mT和频率为8Hz的PEMF处理1小时，或保持未处理，持续4周。b.股骨远端松质骨的代表性显微CT图像。d. CGRP+感觉神经（红色）的定量分,组n = 5。e-h小梁松质骨体积分数（BV/TV）的定量，小梁松质骨数量（Tb.N），松质骨小梁厚度（Tb.Th）和小梁松质骨分离（Tb.Sp）.n = 5。

LepR+ MSCs是感觉神经元的主要靶点
将辣椒素或载体注射到20月龄的LepR-Cre中; tdtomato小鼠1周后建立感觉神经缺失模型，2周后处死小鼠，免疫荧光法证实感觉缺失，辣椒素处理后，与假手术组相比，辣椒素组CGRP+感觉神经数量明显减少（图5a，B）。此外，与假手术组相比，辣椒素组显示BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著降低，Tb.Sp增加（图5c、d）。

图5 感觉神经元主要靶向LepR+MSCs。c股骨远端松质骨的代表性显微CT图像。d小梁松质骨体积分数（BV/TV）、小梁松质骨数量的定量（Tb.N），松质骨小梁厚度（Tb.Th）和小梁松质骨分离（Tb.Sp）. n =每组5个生物学重复。

LepR⁺ MSCs中Nrp1的缺失干扰PEMF诱导的骨形成
与AdvillinCre; iDTR小鼠中的骨表型相似，当与假Nrp1^WT小鼠（Nrp1^wt）相比时，PEMF处理的Nrp1^WT小鼠中的骨形成参数证明了PEMF诱导的骨形成，而这种作用在Npr 1_LepR-/-小鼠中被消除（图6d、e）。

图6 | LepR⁺ MSCs的Nrp1参与了PEMF诱导的骨形成。对20月龄的雄性LepR-Cre进行行为测试：NRP1（Nrp1_LepR-/-）小鼠和Nrp 1 flox/flox（Nrp1^wt）小鼠。d-j用强度为3.8 mT、频率为8 Hz的PEMF处理20月龄雄性Nrp1_LepR-/-小鼠和Nrp1^wt小鼠1小时，或保持未处理。d股骨远端松质骨的代表性显微CT图像。e小梁松质骨体积分数（BV/TV）的定量，小梁松质骨数量（Tb.N）、小梁松质骨厚度（Tb.Th）和小梁松质骨分离（Tb.Sp）。n = 5。

 Micro CT (型号：NEMO) (平生医疗科技)
影像软件：Avatar（平生医疗科技）