提高PCR产物回收率的实用技巧（分模块整理）
2026-01-14 来源:本站 点击次数:240
提高回收率的实用技巧（分模块整理）
操作前准备
使用新鲜配制的电泳缓冲液（1×TAE），避免pH偏高影响后续结合效果；
若PCR反应含石蜡油，建议提前清除，以免降低回收率；
上样量可适当增加，尤其当DNA含量较低时，有助于提高最终回收总量。
电泳与切胶阶段
配置合适浓度的琼脂糖凝胶（如分离500 bp以下片段用≥2.5%胶）以确保分辨率；
切胶时使用长波长UV灯（365 nm），快速准确切割目的条带，减少DNA损伤；
尽量减小切胶体积，只保留含目标条带的部分，避免过多无关凝胶稀释样品。
起因：影响回收率的关键因素
PCR产物纯化过程中，DNA需先吸附于硅胶膜或树脂上，再经洗涤去除非特异性杂质，最后洗脱获得纯净DNA。任何一步操作不当都可能导致DNA损失。常见影响因素包括：
不同长度的DNA片段回收效率存在差异：小片段（<500 bp）易在漂洗中丢失，而大片段（>2 kbp）则因结合力强更难洗脱。因此应根据目标片段大小选择合适的试剂盒和参数。
纯化试剂盒使用优化
特殊情况处理
大片段DNA（>2 kbp）：优先选用氧化硅基质法（如NucleoTrap®）而非硅胶膜法，防止机械剪切损伤；
低浓度模板：可通过多管PCR合并回收的方式提高总产量；
手工法替代：若不用试剂盒，可用酚/氯仿抽提+乙醇沉淀法，但效率较低且耗时较长。
建议：最大化回收率的操作清单
电泳前：确保PCR特异性好，无非特异条带；否则必须切胶回收；
切胶时：动作迅速，控制在3分钟内完成，减少UV伤害；
纯化中：
洗脱液预热（50–60°C）
洗脱体积控制在30–50 μl（不宜过少）
可尝试封口膜密封后4℃过夜再离心，提升洗脱效果；
纯化后：用电泳和NanoDrop检测回收结果，评估纯度与浓度。
操作前准备
使用新鲜配制的电泳缓冲液（1×TAE），避免pH偏高影响后续结合效果；
若PCR反应含石蜡油，建议提前清除，以免降低回收率；
上样量可适当增加，尤其当DNA含量较低时，有助于提高最终回收总量。
电泳与切胶阶段
配置合适浓度的琼脂糖凝胶（如分离500 bp以下片段用≥2.5%胶）以确保分辨率；
切胶时使用长波长UV灯（365 nm），快速准确切割目的条带，减少DNA损伤；
尽量减小切胶体积，只保留含目标条带的部分，避免过多无关凝胶稀释样品。
起因：影响回收率的关键因素
PCR产物纯化过程中，DNA需先吸附于硅胶膜或树脂上，再经洗涤去除非特异性杂质，最后洗脱获得纯净DNA。任何一步操作不当都可能导致DNA损失。常见影响因素包括：
- 洗脱液体积过大或温度过低
- 切胶不精准导致目标片段丢失
- 结合条件不佳（如盐浓度、pH值）
- 乙醇残留抑制后续反应
不同长度的DNA片段回收效率存在差异：小片段（<500 bp）易在漂洗中丢失，而大片段（>2 kbp）则因结合力强更难洗脱。因此应根据目标片段大小选择合适的试剂盒和参数。
纯化试剂盒使用优化
| 操作步骤 | 推荐做法 |
| 溶胶/结合 | 加入适量溶胶液（一般≤750 μl），可添加30%异丙醇增强DNA与膜的结合 |
| 若pH偏高，可在溶胶液中加入10 μl pH 5.0的3 mol/L NaAC调节酸碱性 | |
| 漂洗 | 多次漂洗并充分离心，确保去除引物、dNTP、酶等杂质 |
| 漂洗后将吸附柱开盖离心2分钟或室温放置10分钟，彻底挥发乙醇 | |
| 洗脱 | 洗脱液预热至50–60°C，滴加于膜中央，静置1–5分钟后离心 |
| 可进行二次洗脱：将第一次洗脱液重新加入柱子，再次离心，进一步提高回收率 |
特殊情况处理
大片段DNA（>2 kbp）：优先选用氧化硅基质法（如NucleoTrap®）而非硅胶膜法，防止机械剪切损伤；
低浓度模板：可通过多管PCR合并回收的方式提高总产量；
手工法替代：若不用试剂盒，可用酚/氯仿抽提+乙醇沉淀法，但效率较低且耗时较长。
建议：最大化回收率的操作清单
电泳前：确保PCR特异性好，无非特异条带；否则必须切胶回收；
切胶时：动作迅速，控制在3分钟内完成，减少UV伤害；
纯化中：
洗脱液预热（50–60°C）
洗脱体积控制在30–50 μl（不宜过少）
可尝试封口膜密封后4℃过夜再离心，提升洗脱效果；
纯化后：用电泳和NanoDrop检测回收结果，评估纯度与浓度。
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