染色质免疫共沉淀（ChIP）技术的原理及实验步骤深度揭秘
2026-01-16 来源:本站 点击次数:114简介
染色质免疫沉淀（ChIP）技术，是表观遗传学研究里的 “明星方法”，能快速锁定蛋白质和 DNA 的结合位点，揭开二者互作的神秘面纱。
染色质免疫沉淀（ChIP）技术，是表观遗传学研究里的 “明星方法”，能快速锁定蛋白质和 DNA 的结合位点，揭开二者互作的神秘面纱。
这项技术的底层逻辑是抗原抗体的特异性识别：用特定抗体 “钓取” 目标 DNA 结合蛋白，同时把它结合的 DNA 片段一起富集起来，最终就能在全基因组层面，搞清楚细胞或组织里蛋白质和 DNA 到底是怎么 “互动” 的。
技术原理
ChIP 技术的关键在于 “锁住” 蛋白质和 DNA 的真实结合状态：先在细胞正常生长的条件下，用化学试剂把 DNA 和结合在上面的蛋白质 “粘” 在一起，避免后续操作中二者分离；接着用超声或酶把缠结的染色质剪成小段，方便后续精准筛选；再用专门识别目的蛋白的抗体，把 “蛋白 - DNA” 复合物 “抓” 出来，实现特异性富集。
整个实验要经过细胞固定、染色质剪碎、免疫沉淀、解除交联、DNA 提纯、DNA 检测这几步。不过因为步骤多、每一步的操作细节都容易影响结果，所以做实验时一定要设置对照，而且得结合经验判断结果是否可靠，这样才能避免实验白做。
研究意义
实验材料
一、核心器材
二、试剂与耗材
核酸与蛋白质作为生命活动的核心生物大分子，二者之间的动态相互作用是调控各类生命进程的基础，贯穿细胞生长、增殖、分化、遗传信息传递及代谢稳态维持等关键生理过程。深入解析蛋白质与核酸的互作机制，是揭开生命现象本质、阐明疾病发生发展分子机理的核心突破口。而染色质免疫沉淀（ChIP）技术，凭借其能在生理状态下捕获蛋白质与DNA天然结合状态的优势，成为表观遗传学及分子生物学领域中，研究蛋白质-DNA互作关系、挖掘基因表达调控网络的核心工具，为疾病机制研究、药物靶点筛选等提供了重要技术支撑。
一、核心器材
静音混合器、高速低温离心机、超声破碎仪、电泳仪、水平电泳槽、普通PCR仪、实时荧光定量PCR仪（Real-time PCR仪）。
1. 细胞样本：HeLa细胞；
2. 缓冲液及基础试剂：HEPES、NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠（SDS）、NaHCO₃、去氧胆酸钠、乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物、蛋白酶K；
3. 免疫沉淀相关试剂：Protein A/G磁珠（预结合鲑精DNA封闭）；
4. 对照及检测试剂：GAPDH对照引物、阳性对照抗体（乙酰化组蛋白H3抗体，Anti-Acetyl Histone H3）、阴性对照抗体（正常家兔IgG，Normal IgG）；
5. 核酸检测试剂：琼脂糖、PCR反应Mix、SYBR Green qPCR Mix。
三、实验步骤
（二）细胞固定
ChIP实验核心流程可分为试剂配制、细胞固定、染色质断裂、免疫沉淀等关键环节，其中试剂配制与细胞固定是保障实验成功的基础，具体操作如下：
（一）试剂配制
所有缓冲液需提前配制并调节至对应pH值，蛋白酶抑制剂需临用前新鲜加入，避免酶解目标蛋白，具体配方如下：
（1）裂解缓冲液（FA Lysis Buffer）：50 mmol／L HEPES-KOH（pH 7.5）、140 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1％ Triton X-100、0.1％ 去氧胆酸钠、0.1％ SDS，临用前加入适量蛋白酶抑制剂。
（2）RIPA缓冲液：50 mmol／L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1% NP-40、0.5％ 去氧胆酸钠、0.1％ SDS，临用前加入适量蛋白酶抑制剂。
（3）漂洗缓冲液（Wash Buffer）：0.1％ SDS、1％ Triton X-100、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。
（4）最终漂洗缓冲液（Final Wash Buffer）：0.1％ SDS、1% Triton X-100、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。
细胞固定的核心是在生理状态下交联DNA与蛋白质，维持二者天然结合状态，操作需轻柔以避免细胞破裂，步骤如下：
（1）取直径150 mm培养皿，待培养的HeLa细胞汇合度达80%~90%（细胞数量约1×10⁷个）时进行实验；向培养皿中20 ml培养基内，加入550 μl 37%甲醛（或1100 μl 18.5%甲醛），使甲醛终浓度为1%。
（2）轻柔晃动培养皿混匀，室温孵育10 min，确保交联充分且均匀。
（3）终止交联：加入甘氨酸至终浓度125 mmol／L，轻柔混匀后室温孵育5 min，彻底终止甲醛的交联作用。
（4）将培养皿转移至冰上预冷，抑制细胞内源性酶活性，防止目标复合物降解。
（5）小心吸尽培养基，加入20 ml冰冷的PBS，轻柔清洗细胞表面残留培养基及试剂。
（6）吸尽PBS，重复上述PBS清洗步骤1次，确保清洗彻底。
（7）加入2 ml含1×蛋白酶抑制剂复合物的冰冷PBS，用细胞刮刀沿培养皿壁轻柔刮取细胞，收集至1.5 ml离心管中。
（8）置于高速低温离心机，1000 g、4 ℃条件下离心5 min，收集细胞沉淀。
（9）吸弃上清液，向细胞沉淀中加入750 μl预冷的FA Lysis缓冲液，轻柔吹打重悬细胞，获得细胞裂解液，后续用于染色质断裂步骤。
（三）染色质断裂
（四）染色质免疫沉淀
（五）解交联反应和DNA的纯化
（六）DNA的鉴定
（七）实验结果及分析
注意事项
（1）将含细胞裂解液的离心管置于冰上，进行超声破碎。超声参数设定为：功率310 W，冲击20 s，间隔2 s，共进行3个循环。需注意，超声条件具有细胞系特异性，且与细胞数量密切相关，需通过预实验摸索确定最优条件。超声过程中，将探头尽量深入管内，但避免接触管底及侧壁，防止产生泡沫影响实验效果。
（2）超声破碎完成后，于4 ℃、10,000 g条件下离心10 min，去除细胞碎片等不溶性杂质。
（3）小心吸取上清液，分装至新的1.5 ml离心管中，每管50 μl，分装后可置于-80 ℃冰箱保存，保存期最长不超过3个月。
（4）取100 μl超声破碎产物，加入5 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K，于65 ℃条件下旋转混匀，进行解交联反应，反应时长为4~5 h（或过夜）。反应结束后，取一半样品进行酚-氯仿抽提，后续通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测超声破碎效果，确保染色质片段符合实验要求。
（1）将每管50 μl的超声破碎产物按1:10比例稀释，加入450 μl RIPA缓冲液，轻轻混匀。从中吸取5 μl（占总体积的1%）作为Input对照，置于4 ℃保存，备用（用于后续第4步验证）。
（2）向每个样品管中分别加入阳性对照抗体、阴性对照抗体（正常IgG）及目标蛋白抗体，抗体用量范围为1~10 μg。由于抗体的效力、纯度及特异性存在差异，建议通过抗体梯度稀释实验，确定该实验体系的最适抗体用量。
（3）向各管中加入20 μl充分混匀的Protein A／G beads（预结合鲑鱼精DNA，Salmon Sperm DNA），轻柔混匀。
（4）置于4 ℃环境中旋转孵育1 h（或过夜），确保抗体与抗原及beads充分结合形成免疫复合物。
（5）孵育结束后，于2000 g条件下离心1 min，小心弃去上清液，保留beads复合物。
（6）用1 ml Wash缓冲液清洗beads，共清洗3次，每次清洗后于2000 g离心1 min，弃去上清液，彻底去除未结合的杂蛋白及杂质。
（7）最后用1 ml Final Wash缓冲液清洗beads 1次，2000 g离心1 min，弃去上清液，完成beads纯化。
通过蛋白酶K介导的解交联反应释放结合的DNA，随后采用酚-氯仿抽提结合乙醇沉淀法纯化DNA，或直接使用DNA纯化柱回收DNA，具体步骤如下：
（1）向每份样品（含Input对照组）中加入120 μl Elution缓冲液，置于30 ℃环境中旋转孵育15 min，使DNA从免疫复合物中洗脱。
（2）于2000 g条件下离心1 min，收集上清液。
（3）将上清液转移至新的离心管中，可暂时置于-20 ℃保存。
（4）向各管中加入5 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K，65 ℃条件下旋转混匀，进行二次解交联反应，时长4~5 h（或过夜），确保交联完全解除。
（5）对解交联后的样品进行酚-氯仿抽提，后续通过乙醇沉淀法纯化DNA，纯化后加入100 μl无菌水溶解DNA，置于-20 ℃保存备用。
ChIP实验回收DNA的常用鉴定方法为半定量PCR和实时荧光定量PCR（Real-time PCR），可通过扩增特异性靶序列验证实验有效性及富集效率。
（1）交联后的染色质经超声断裂后，通过2%琼脂糖凝胶电泳分析，合格的破碎效果应满足：染色质片段平均长度在200~1000 bp之间，片段分布均匀，无明显拖尾或大片段残留。
（2）对纯化后的DNA片段进行PCR扩增验证，选取管家基因GAPDH的启动子区作为扩增靶序列（扩增片段大小为165 bp）。理想结果为：阳性对照及Input对照均能检测到清晰的扩增条带，无DNA模板的空白对照无扩增条带，阴性对照（正常IgG）可出现微弱扩增条带，但条带亮度与阳性对照存在显著差异，表明实验特异性良好。
（1）甲醛交联时间需通过预实验确定，因其受细胞类型、细胞数量影响较大。交联时间过长会导致实验材料丢失，且增加超声破碎难度；交联时间过短则会造成交联不完全，影响免疫沉淀效果。
（2）超声破碎通过机械力断裂染色质，过程中易产生热量及泡沫，导致蛋白质变性，降低ChIP效率。因此，超声操作需全程在冰上进行，采用时断时续的超声程序，避免长时间连续超声，防止蛋白质降解及染色质结构破坏。
（3）ChIP实验需设置完善的对照体系，缺少对照会无法评估实验结果的可靠性。阳性抗体对照、阴性抗体（正常IgG）对照为基础对照；Input对照不仅可验证染色质破碎效果，还能根据Input及沉淀样品中靶序列的含量，按取样比例计算ChIP富集效率，是实验有效性验证的关键。
（4）目标蛋白抗体的选择是ChIP实验成功的核心。蛋白质与染色质交联后，抗体的抗原表位可能被掩盖（与染色质结合位点过近），导致抗体无法识别，影响免疫复合物形成。因此，并非所有抗体均适用于ChIP实验，需选用经ChIP实验验证合格的抗体，以保障实验结果的准确性和可靠性。
乐备实（上海优宁维生物科技股份有限公司旗下全资子公司），是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务专家，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到单细胞测序、空间多组学、流式检测、超敏电化学发光、Luminex多因子检测、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫组化、DSP空间多组学等30多个，建立起了一套涵盖基因、蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。
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