血管活性肠多肽(VIP)在大鼠咬肌副交感神经血管舒张中的作用
2026-01-16 来源:本站 点击次数:32
北海道健康科学大学牙科学院口腔生物学系生理学分部的Takeharu Niioka团队的研究成果“Involvement of vasoactive intestinal polypeptide in the parasympathetic vasodilatation of the rat masseter muscle”发表于《Archives of Oral Biology》期刊。该研究聚焦大鼠咬肌，旨在探究三个问题：（1）支配血管的副交感神经是否具有血管活性肠多肽（VIP）免疫反应性；（2）静脉注射VIP是否会诱导咬肌血管舒张；（3）选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP在有无阿托品存在的情况下，对副交感神经血管舒张的影响。
摘要
已知大鼠咬肌内的血管受副交感神经支配，其血管舒张通过胆碱能和非胆碱能两种机制实现，但非胆碱能机制尚未明确。近年来，有充分证据表明血管活性肠多肽（VIP）参与了口面部（如下颌下腺和下唇）的副交感神经血管舒张过程，然而关于其在大鼠咬肌中的作用却知之甚少。
本研究以大鼠咬肌为研究对象，开展了以下探究：（1）支配血管的副交感神经是否具有VIP免疫反应性；（2）静脉注射VIP是否会诱导血管舒张；（3）选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP在有无阿托品存在时，对副交感神经血管舒张的影响。研究发现，在副交感耳神经节和血管周围的神经纤维这两个部位均检测到了VIP免疫反应性；静脉注射VIP可诱导咬肌血管舒张，且[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP能减弱VIP注射引发的血管舒张效应；单独使用[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP时，无法抑制副交感神经血管舒张，但当[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP与阿托品联合使用时，可降低副交感神经血管舒张效应。这些结果表明：（1）支配咬肌血管的节后副交感神经中存在VIP；（2）静脉注射VIP可诱导咬肌血管舒张；（3）当毒蕈碱胆碱能受体被阿托品阻断或乙酰胆碱（ACh）释放受抑制时，VIP可能参与咬肌的副交感神经血管舒张调节。
实验材料与仪器
（一）实验材料
1. 动物：成年雄性Wistar大鼠（体重260-640g）
2. 试剂：荧光金、无菌生理盐水、戊巴比妥钠、乌拉坦、乙醚、泮库溴铵、4%多聚甲醛、0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.4）、30%蔗糖、1%非免疫驴血清、0.3%曲拉通X-100、0.3%牛血清白蛋白、VIP抗体、囊泡乙酰胆碱转运体抗体、Alexa-488标记的驴抗兔IgG抗体、Alexa-568标记的驴抗山羊IgG抗体、荧光素蓖麻凝集素I、VIP、选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP、阿托品
3. 其他：明胶包被玻片
（二）实验仪器
Hamilton微量注射器、冷冻切片机、荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、插管器械
、加热垫、Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪
实验过程
1.动物饲养
实验大鼠采用12小时光照/12小时黑暗的饲养周期，自由摄食饮水。
2.荧光双标记法：荧光金逆行运输结合VIP或VAChT免疫组化
1. 大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉后，在颊部皮肤做小切口暴露咬肌表面，用Hamilton微量注射器向咬肌内垂直注射1μL 2%荧光金，注射速度0.1ml/min，注射后留针2分钟以防回流。
2. 48-72小时后，用戊巴比妥钠深度麻醉大鼠，先以250ml生理盐水灌注，再用500ml 4%多聚甲醛灌注。
3. 取出耳神经节（OG），浸泡于含30%蔗糖的冰冷缓冲液中，用冷冻切片机将其切成40μm切片，对所有切片进行VIP和VAChT免疫组化染色。
4. 染色后将切片置于明胶包被玻片上，用荧光显微镜观察FG标记神经元、VIP及VAChT免疫反应性，计数每个耳神经节切片中同时被FG与VIP或VAChT抗体标记的神经元胞体数量，并计算其占FG标记神经元总数的百分比（每个耳神经节组织制备6-9个切片）。
3.VIP和VAChT的免疫组化染色
1. 取出耳神经节和咬肌，浸泡于含30%蔗糖的冰冷缓冲液中，将两者切成100μm切片，用磷酸盐缓冲盐水冲洗后，在含1%非免疫驴血清、0.3%曲拉通X-100和0.3%牛血清白蛋白的封闭液中孵育至少3小时。
2. 将切片置于含VIP抗体和VAChT抗体的封闭液中，4℃孵育2天；经磷酸盐缓冲盐水冲洗后，再置于含Alexa-488标记的驴抗兔IgG抗体和/或Alexa-568标记的驴抗山羊IgG抗体的封闭液中，4℃孵育1天。
3. 部分咬肌切片仅用VIP抗体和Alexa-568标记的驴抗兔IgG抗体进行免疫组化染色，染色后在4℃下与20mg/ml荧光素蓖麻凝集素I（RCA-I）孵育30分钟（RCA-I为啮齿动物血管壁标志物）。
4. 冲洗后将切片置于明胶包被玻片上，用共聚焦激光扫描显微镜观察荧光；对照组实验通过在孵育液中省略一抗或二抗进行。
4.咬肌血流量（MBF）测量
1. 大鼠经乙醚吸入诱导麻醉后，腹腔注射乌拉坦维持麻醉，对股静脉和股动脉进行插管，分别用于药物注射和监测全身动脉血压（SABP）。
2. 对大鼠进行气管插管，静脉注射泮库溴铵（初始剂量0.6mg/kg，之后每小时左右补充0.4mg/kg）使其麻痹，通过气管插管给予50%空气-50%氧气混合气体人工通气，用加热垫维持直肠温度在37℃。
3. 实验前切断颈部双侧颈迷走神经和双侧颈上交感干，以排除迷走神经对心血管系统的反射作用及交感缩血管纤维对口面部的影响。
电刺激左侧舌神经（LN）的中枢切断端以诱发咬肌副交感神经反射性血管舒张，使用Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪监测监测并记录咬肌血流量变化，通过血流仪图表上的反应高度量化血流量变化（结果以任意单位表示）。
(C) 在选择性血管活性肠肽受体拮抗剂（[4 - 氯 - D - 苯丙氨酸⁶, 亮氨酸 ¹⁷] - 血管活性肠肽）存在及缺失情况下，注射 100 ng/kg VIP 诱发局部血流量（MBF）升高的典型示例。
(D) [4 - 氯 - D - 苯丙氨酸⁶, 亮氨酸 ¹⁷] - 血管活性肠肽对 100 ng/kg VIP 诱发局部血流量（MBF）升高效应的影响，以用药前反应的百分比表示（n = 5）。
5. 分别以0（仅生理盐水）、1、10、100ng/kg剂量的VIP（溶于生理盐水）经导管注射，观察咬肌血流量变化；在注射VIP前20分钟，持续注射0.1mg/ml的[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP（注射速度2ml/min），观察其对VIP诱导的咬肌血流量变化的影响。
6. 分别在静脉注射阿托品（0.1mg/kg）后、持续输注[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP时、同时使用两种药物时，电刺激舌神经，将各处理后的数据以处理前（对照）反应的百分比表示。
5.统计分析
所有数据以平均值±标准误（mean±SEM）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合双侧Dunnett检验或Tukey校正评估测试反应变化的统计学显著性，P<0.05视为差异具有统计学意义，数据采用SPSS 16.0软件（Windows系统）进行分析。
实验结论
1. 支配大鼠咬肌血管的节后副交感神经中存在VIP免疫反应性，且VIP与囊泡乙酰胆碱转运体（VAChT，胆碱能标志物）在耳神经节的FG标记神经元胞体及咬肌血管周围的神经纤维上共定位。
2. 静脉注射VIP可以剂量依赖方式诱导大鼠咬肌血管舒张，且不影响全身动脉血压；选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP能抑制VIP诱导的咬肌血管舒张，表明VIP可能通过激活咬肌血管壁上的VIP受体发挥血管舒张作用。
3. 单独使用[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP无法抑制舌神经电刺激诱发的咬肌副交感神经血管舒张；单独使用阿托品可使该血管舒张效应降低约36%；而当[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP与阿托品联合使用时，血管舒张效应降低约66%。这表明当毒蕈碱胆碱能受体被阿托品阻断或乙酰胆碱（ACh）释放受抑制时，VIP可能参与咬肌的副交感神经血管舒张调节。
摘要
已知大鼠咬肌内的血管受副交感神经支配，其血管舒张通过胆碱能和非胆碱能两种机制实现，但非胆碱能机制尚未明确。近年来，有充分证据表明血管活性肠多肽（VIP）参与了口面部（如下颌下腺和下唇）的副交感神经血管舒张过程，然而关于其在大鼠咬肌中的作用却知之甚少。
本研究以大鼠咬肌为研究对象，开展了以下探究：（1）支配血管的副交感神经是否具有VIP免疫反应性；（2）静脉注射VIP是否会诱导血管舒张；（3）选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP在有无阿托品存在时，对副交感神经血管舒张的影响。研究发现，在副交感耳神经节和血管周围的神经纤维这两个部位均检测到了VIP免疫反应性；静脉注射VIP可诱导咬肌血管舒张，且[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP能减弱VIP注射引发的血管舒张效应；单独使用[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP时，无法抑制副交感神经血管舒张，但当[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP与阿托品联合使用时，可降低副交感神经血管舒张效应。这些结果表明：（1）支配咬肌血管的节后副交感神经中存在VIP；（2）静脉注射VIP可诱导咬肌血管舒张；（3）当毒蕈碱胆碱能受体被阿托品阻断或乙酰胆碱（ACh）释放受抑制时，VIP可能参与咬肌的副交感神经血管舒张调节。
实验材料与仪器
（一）实验材料
1. 动物：成年雄性Wistar大鼠（体重260-640g）
2. 试剂：荧光金、无菌生理盐水、戊巴比妥钠、乌拉坦、乙醚、泮库溴铵、4%多聚甲醛、0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.4）、30%蔗糖、1%非免疫驴血清、0.3%曲拉通X-100、0.3%牛血清白蛋白、VIP抗体、囊泡乙酰胆碱转运体抗体、Alexa-488标记的驴抗兔IgG抗体、Alexa-568标记的驴抗山羊IgG抗体、荧光素蓖麻凝集素I、VIP、选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP、阿托品
3. 其他：明胶包被玻片
（二）实验仪器
Hamilton微量注射器、冷冻切片机、荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、插管器械
、加热垫、Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪
实验过程
1.动物饲养
实验大鼠采用12小时光照/12小时黑暗的饲养周期，自由摄食饮水。
2.荧光双标记法：荧光金逆行运输结合VIP或VAChT免疫组化
1. 大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉后，在颊部皮肤做小切口暴露咬肌表面，用Hamilton微量注射器向咬肌内垂直注射1μL 2%荧光金，注射速度0.1ml/min，注射后留针2分钟以防回流。
2. 48-72小时后，用戊巴比妥钠深度麻醉大鼠，先以250ml生理盐水灌注，再用500ml 4%多聚甲醛灌注。
3. 取出耳神经节（OG），浸泡于含30%蔗糖的冰冷缓冲液中，用冷冻切片机将其切成40μm切片，对所有切片进行VIP和VAChT免疫组化染色。
4. 染色后将切片置于明胶包被玻片上，用荧光显微镜观察FG标记神经元、VIP及VAChT免疫反应性，计数每个耳神经节切片中同时被FG与VIP或VAChT抗体标记的神经元胞体数量，并计算其占FG标记神经元总数的百分比（每个耳神经节组织制备6-9个切片）。
3.VIP和VAChT的免疫组化染色
1. 取出耳神经节和咬肌，浸泡于含30%蔗糖的冰冷缓冲液中，将两者切成100μm切片，用磷酸盐缓冲盐水冲洗后，在含1%非免疫驴血清、0.3%曲拉通X-100和0.3%牛血清白蛋白的封闭液中孵育至少3小时。
2. 将切片置于含VIP抗体和VAChT抗体的封闭液中，4℃孵育2天；经磷酸盐缓冲盐水冲洗后，再置于含Alexa-488标记的驴抗兔IgG抗体和/或Alexa-568标记的驴抗山羊IgG抗体的封闭液中，4℃孵育1天。
3. 部分咬肌切片仅用VIP抗体和Alexa-568标记的驴抗兔IgG抗体进行免疫组化染色，染色后在4℃下与20mg/ml荧光素蓖麻凝集素I（RCA-I）孵育30分钟（RCA-I为啮齿动物血管壁标志物）。
4. 冲洗后将切片置于明胶包被玻片上，用共聚焦激光扫描显微镜观察荧光；对照组实验通过在孵育液中省略一抗或二抗进行。
4.咬肌血流量（MBF）测量
1. 大鼠经乙醚吸入诱导麻醉后，腹腔注射乌拉坦维持麻醉，对股静脉和股动脉进行插管，分别用于药物注射和监测全身动脉血压（SABP）。
2. 对大鼠进行气管插管，静脉注射泮库溴铵（初始剂量0.6mg/kg，之后每小时左右补充0.4mg/kg）使其麻痹，通过气管插管给予50%空气-50%氧气混合气体人工通气，用加热垫维持直肠温度在37℃。
3. 实验前切断颈部双侧颈迷走神经和双侧颈上交感干，以排除迷走神经对心血管系统的反射作用及交感缩血管纤维对口面部的影响。
电刺激左侧舌神经（LN）的中枢切断端以诱发咬肌副交感神经反射性血管舒张，使用Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪监测监测并记录咬肌血流量变化，通过血流仪图表上的反应高度量化血流量变化（结果以任意单位表示）。
Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪
(A) 舌神经电刺激（对照组）以及静脉注射不同剂量血管活性肠肽（VIP，1、10、100 ng/kg）后，局部血流量（MBF）升高的典型示例。
(B) 静脉注射 0（仅生理盐水）、1、10、100 ng/kg VIP 后，局部血流量（MBF）升高幅度的汇总统计（n = 4）。数据以舌神经电刺激（对照组）诱发反应的百分比表示。(C) 在选择性血管活性肠肽受体拮抗剂（[4 - 氯 - D - 苯丙氨酸⁶, 亮氨酸 ¹⁷] - 血管活性肠肽）存在及缺失情况下，注射 100 ng/kg VIP 诱发局部血流量（MBF）升高的典型示例。
(D) [4 - 氯 - D - 苯丙氨酸⁶, 亮氨酸 ¹⁷] - 血管活性肠肽对 100 ng/kg VIP 诱发局部血流量（MBF）升高效应的影响，以用药前反应的百分比表示（n = 5）。
5. 分别以0（仅生理盐水）、1、10、100ng/kg剂量的VIP（溶于生理盐水）经导管注射，观察咬肌血流量变化；在注射VIP前20分钟，持续注射0.1mg/ml的[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP（注射速度2ml/min），观察其对VIP诱导的咬肌血流量变化的影响。
6. 分别在静脉注射阿托品（0.1mg/kg）后、持续输注[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP时、同时使用两种药物时，电刺激舌神经，将各处理后的数据以处理前（对照）反应的百分比表示。
5.统计分析
所有数据以平均值±标准误（mean±SEM）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合双侧Dunnett检验或Tukey校正评估测试反应变化的统计学显著性，P<0.05视为差异具有统计学意义，数据采用SPSS 16.0软件（Windows系统）进行分析。
实验结论
1. 支配大鼠咬肌血管的节后副交感神经中存在VIP免疫反应性，且VIP与囊泡乙酰胆碱转运体（VAChT，胆碱能标志物）在耳神经节的FG标记神经元胞体及咬肌血管周围的神经纤维上共定位。
2. 静脉注射VIP可以剂量依赖方式诱导大鼠咬肌血管舒张，且不影响全身动脉血压；选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP能抑制VIP诱导的咬肌血管舒张，表明VIP可能通过激活咬肌血管壁上的VIP受体发挥血管舒张作用。
3. 单独使用[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP无法抑制舌神经电刺激诱发的咬肌副交感神经血管舒张；单独使用阿托品可使该血管舒张效应降低约36%；而当[4Cl-D-Phe6, Leu¹⁷]VIP与阿托品联合使用时，血管舒张效应降低约66%。这表明当毒蕈碱胆碱能受体被阿托品阻断或乙酰胆碱（ACh）释放受抑制时，VIP可能参与咬肌的副交感神经血管舒张调节。
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