配体非依赖性VDR作用对皮肤角质形成细胞稳态维持中的作用
2026-01-16 来源:本站 点击次数:33
2025年1月，来自金泽大学的Satoko Kise研究团队在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上发表了题为“Ligand-Independent Vitamin D Receptor Actions Essential for Keratinocyte Homeostasis in the Skin”的研究。该研究旨在阐明维生素D和维生素D受体（VDR）在皮肤中的作用机制，通过对比维生素D受体基因缺陷Vdr-KO大鼠、Vdr-R270L/H301Q突变大鼠（缺乏配体结合能力）和WT大鼠的皮肤蛋白质组成和基因表达模式，探究配体非依赖性VDR作用在皮肤角质形成细胞稳态维持中的重要性。
摘要
最近，我们发现维生素D受体基因缺陷（Vdr-KO）大鼠出现的脱发症状，在具有配体结合能力缺陷的突变型VDR（R270L/H301Q）大鼠中并未出现，这表明VDR的配体非依赖性作用在维持毛发周期中起着重要作用。由于Vdr-KO大鼠的皮肤也存在异常，本研究进一步探讨了脱发与皮肤异常之间的关系。为阐明维生素D和VDR在皮肤中的作用机制，我们对比了Vdr-KO、Vdr-R270L/H301Q及野生型（WT）大鼠皮肤的蛋白质组成和基因表达模式。结果显示，Vdr-R270L/H301Q大鼠的皮肤形成与WT大鼠类似，均表现正常，而Vdr-KO大鼠则出现明显的角化过度和经表皮水分流失现象。RNA测序和蛋白质组学分析表明，Vdr-KO大鼠的基因和蛋白质表达模式与WT及Vdr-R270L/H301Q大鼠存在明显差异：Shh、Wnt和Bmp信号通路相关因子的表达降低，毛发角蛋白表达急剧减少，表皮角蛋白表达则大幅增加。本研究证实，无配体结合的VDR在毛囊和表皮角质形成细胞的分化、增殖及细胞死亡过程中具有重要作用。
关键词：维生素D受体；角质形成细胞稳态；配体非依赖性VDR作用；角化过度；脱发
实验材料与仪器
实验材料
1. 实验动物：Jcl:Wistar大鼠，包括野生型（WT）大鼠、Vdr-KO（维生素D受体基因缺陷）大鼠、Vdr-R270L/H301Q（VDR双突变）大鼠，均为雄性。
2. 主要试剂：4%多聚甲醛、O.T.C.复合物、抗VDR抗体、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG、苏木精、伊红-酒精溶液、脱脂奶粉、Tris缓冲盐水（TBS）、Tween 20、辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗、ISOGEN II等。
3. 抗体：抗细胞角蛋白14多克隆兔抗体、PCK-26抗体、β-肌动蛋白抗体等。
实验仪器
冷冻切片机、相差显微镜、Minylis个人均质器、SDS-PAGE凝胶电泳相关设备、转膜设备、增强化学发光免疫检测系统、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪
实验过程
1. 动物饲养与分组：所有大鼠均饲养在室温22-26℃、湿度50-55%、12小时光照/黑暗周期的环境中，自由进食饮水（饲料为CE-2，Oriental Yeast Co.）。实验分为WT组、Vdr-KO组和Vdr-R270L/H301Q（KI）组，每组3只大鼠，均为雄性。通过PCR产物电泳确定KO大鼠的基因型，Vdr-KO纯合子通过纯合子交配维持。
2. 样本采集：在大鼠4周、7周、11周、15周、22周、30周等不同年龄段，剃除背部毛发后，剪取背部皮肤组织，部分样本用于固定冷冻，部分样本迅速液氮冷冻后研磨成粉末用于RNA提取或蛋白质提取。
3. 免疫荧光检测：皮肤样本经4% PFA固定15小时（4℃），O.T.C.复合物包埋后液氮冷冻，用冷冻切片机制作20μm厚切片。加入抗VDR抗体和Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗进行免疫荧光染色，DAPI染色细胞核后，相差显微镜观察VDR定位。
4. HE染色：皮肤样本经4% PFA固定15小时（4℃），O.T.C.复合物包埋液氮冷冻，制作20-25μm厚冷冻切片。经PFA复固定、水洗、苏木精染色15分钟、水洗、伊红-酒精染色2分钟，再经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，相差显微镜观察皮肤形态。
5. Western blot分析：剪取的皮肤组织用Minylis个人均质器匀浆，提取总蛋白（每泳道上样20μg），进行4-20%线性梯度SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗孵育，TBS-T洗涤3次，再加入HRP偶联二抗孵育，最后通过增强化学发光免疫检测法检测目标蛋白（Krt14、Krt1、Krt5、Krt8、VDR、β-actin等）表达。
6.TEWL检测：剃除大鼠背部毛发后，使用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪，基于菲克定律（TEWL = D×dC/dx，D为水蒸气在空气中的扩散系数，dC/dx为传感器测量的水蒸气浓度梯度）计算经表皮水分流失量，评估皮肤屏障功能。
实验结论
本研究通过对比WT、Vdr-KO和完全缺乏配体结合能力的新型KI大鼠，明确证实无配体结合的VDR（配体非依赖性VDR）在毛囊和表皮角质形成细胞的分化、增殖及凋亡过程中发挥作用。具体结论如下：
1. 配体非依赖性VDR是维持毛发周期所必需的Shh、Wnt或Bmp通路相关基因表达的关键因素，Vdr-KO大鼠中这些通路基因表达降低，导致脱发和毛囊异常。
2. 即使缺乏VDR，初始毛发周期仍可经历生长期和退行期，但从退行期向休止期的转变需要VDR依赖的毛囊上皮链凋亡过程，Vdr-KO大鼠中该凋亡过程受阻，形成囊肿并持续增殖，导致皮肤表面波纹状改变。
3. Vdr-KO大鼠出现明显的角化过度、表皮角蛋白表达上调、毛发角蛋白表达降低，经表皮水分流失增加，皮肤屏障功能受损，且可能存在慢性炎症，而KI大鼠皮肤表型与WT大鼠一致，表明配体非依赖性VDR对皮肤结构和功能维持至关重要。
4. 促进Shh、Wnt和Bmp信号通路的化合物有望成为治疗VDR缺乏相关脱发和皮肤疾病的潜在药物。
摘要
最近，我们发现维生素D受体基因缺陷（Vdr-KO）大鼠出现的脱发症状，在具有配体结合能力缺陷的突变型VDR（R270L/H301Q）大鼠中并未出现，这表明VDR的配体非依赖性作用在维持毛发周期中起着重要作用。由于Vdr-KO大鼠的皮肤也存在异常，本研究进一步探讨了脱发与皮肤异常之间的关系。为阐明维生素D和VDR在皮肤中的作用机制，我们对比了Vdr-KO、Vdr-R270L/H301Q及野生型（WT）大鼠皮肤的蛋白质组成和基因表达模式。结果显示，Vdr-R270L/H301Q大鼠的皮肤形成与WT大鼠类似，均表现正常，而Vdr-KO大鼠则出现明显的角化过度和经表皮水分流失现象。RNA测序和蛋白质组学分析表明，Vdr-KO大鼠的基因和蛋白质表达模式与WT及Vdr-R270L/H301Q大鼠存在明显差异：Shh、Wnt和Bmp信号通路相关因子的表达降低，毛发角蛋白表达急剧减少，表皮角蛋白表达则大幅增加。本研究证实，无配体结合的VDR在毛囊和表皮角质形成细胞的分化、增殖及细胞死亡过程中具有重要作用。
关键词：维生素D受体；角质形成细胞稳态；配体非依赖性VDR作用；角化过度；脱发
实验材料与仪器
实验材料
1. 实验动物：Jcl:Wistar大鼠，包括野生型（WT）大鼠、Vdr-KO（维生素D受体基因缺陷）大鼠、Vdr-R270L/H301Q（VDR双突变）大鼠，均为雄性。
2. 主要试剂：4%多聚甲醛、O.T.C.复合物、抗VDR抗体、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG、苏木精、伊红-酒精溶液、脱脂奶粉、Tris缓冲盐水（TBS）、Tween 20、辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗、ISOGEN II等。
3. 抗体：抗细胞角蛋白14多克隆兔抗体、PCK-26抗体、β-肌动蛋白抗体等。
实验仪器
冷冻切片机、相差显微镜、Minylis个人均质器、SDS-PAGE凝胶电泳相关设备、转膜设备、增强化学发光免疫检测系统、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪
实验过程
1. 动物饲养与分组：所有大鼠均饲养在室温22-26℃、湿度50-55%、12小时光照/黑暗周期的环境中，自由进食饮水（饲料为CE-2，Oriental Yeast Co.）。实验分为WT组、Vdr-KO组和Vdr-R270L/H301Q（KI）组，每组3只大鼠，均为雄性。通过PCR产物电泳确定KO大鼠的基因型，Vdr-KO纯合子通过纯合子交配维持。
2. 样本采集：在大鼠4周、7周、11周、15周、22周、30周等不同年龄段，剃除背部毛发后，剪取背部皮肤组织，部分样本用于固定冷冻，部分样本迅速液氮冷冻后研磨成粉末用于RNA提取或蛋白质提取。
3. 免疫荧光检测：皮肤样本经4% PFA固定15小时（4℃），O.T.C.复合物包埋后液氮冷冻，用冷冻切片机制作20μm厚切片。加入抗VDR抗体和Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗进行免疫荧光染色，DAPI染色细胞核后，相差显微镜观察VDR定位。
4. HE染色：皮肤样本经4% PFA固定15小时（4℃），O.T.C.复合物包埋液氮冷冻，制作20-25μm厚冷冻切片。经PFA复固定、水洗、苏木精染色15分钟、水洗、伊红-酒精染色2分钟，再经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，相差显微镜观察皮肤形态。
5. Western blot分析：剪取的皮肤组织用Minylis个人均质器匀浆，提取总蛋白（每泳道上样20μg），进行4-20%线性梯度SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗孵育，TBS-T洗涤3次，再加入HRP偶联二抗孵育，最后通过增强化学发光免疫检测法检测目标蛋白（Krt14、Krt1、Krt5、Krt8、VDR、β-actin等）表达。
6.TEWL检测：剃除大鼠背部毛发后，使用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪，基于菲克定律（TEWL = D×dC/dx，D为水蒸气在空气中的扩散系数，dC/dx为传感器测量的水蒸气浓度梯度）计算经表皮水分流失量，评估皮肤屏障功能。
ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪
实验结论
本研究通过对比WT、Vdr-KO和完全缺乏配体结合能力的新型KI大鼠，明确证实无配体结合的VDR（配体非依赖性VDR）在毛囊和表皮角质形成细胞的分化、增殖及凋亡过程中发挥作用。具体结论如下：
1. 配体非依赖性VDR是维持毛发周期所必需的Shh、Wnt或Bmp通路相关基因表达的关键因素，Vdr-KO大鼠中这些通路基因表达降低，导致脱发和毛囊异常。
2. 即使缺乏VDR，初始毛发周期仍可经历生长期和退行期，但从退行期向休止期的转变需要VDR依赖的毛囊上皮链凋亡过程，Vdr-KO大鼠中该凋亡过程受阻，形成囊肿并持续增殖，导致皮肤表面波纹状改变。
3. Vdr-KO大鼠出现明显的角化过度、表皮角蛋白表达上调、毛发角蛋白表达降低，经表皮水分流失增加，皮肤屏障功能受损，且可能存在慢性炎症，而KI大鼠皮肤表型与WT大鼠一致，表明配体非依赖性VDR对皮肤结构和功能维持至关重要。
4. 促进Shh、Wnt和Bmp信号通路的化合物有望成为治疗VDR缺乏相关脱发和皮肤疾病的潜在药物。
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