中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系广泛应用于生物制药行业，特别是用于生产单克隆抗体和重组蛋白药物。重组细胞系通常来源于单细胞克隆，以确保产品的一致性和稳定性。然而，难以表达的重组蛋白可能会抑制单细胞增殖，从而显著降低克隆效率。如何提高“难表达蛋白”的单克隆化效率和重组蛋白产量呢，齐鲁制药新发表在《Protein Expression and Purification》上的文章提供了新思路。

 
研究内容
 
1. 问题背景：

CHO细胞是生产治疗性蛋白（如单克隆抗体）的关键平台，但表达“难表达蛋白”时会显著抑制细胞增殖，导致单克隆化效率低（即单细胞形成克隆的成功率低），延缓细胞株开发进程。

2. 创新策略：
 
构建共表达载体 pCGS3.0-IGF1-P04，将胰岛素样生长因子-1（IGF-1，其可促进细胞周期进程并抑制凋亡。）基因通过内部核糖体进入位点（IRES）与目标难表达蛋白 P04 串联，转染至 CHOZN® GS-/-细胞中。IGF-1共表达通过显著提高克隆效率并实现难以表达蛋白的稳定生产，代表了一种有效的单细胞克隆策略。
 

 
3. 关键技术：

使用 Cytena Single-Cell Printer™ 进行全自动单细胞分选，确保单克隆源性。

- 通过成像系统追踪单细胞增殖，定量克隆效率。 
- 在两种培养基（A/B）中评估细胞生长、蛋白产量及代谢参数。

IGF-1共表达使细胞的单克隆效率在Medium A中为53.3%，较对照组提高了196%；在Medium B中为89%，较对照组提高了53%。

首先，使用 Cytena Single-Cell Printer进行自动单细胞分选。随后，使用成像仪监测单克隆细胞的铺板效率和生长。到第14天，在两种培养基中，IGF-1共表达克隆细胞表现出比对照细胞显著更高的汇合度和增殖能力。

在分选当天（第 0 天），所有组的单细胞铺板效率在95%到97%之间（图A）。根据第0天和第1天收集的成像数据，证实了所有组的单细胞铺板效率约为90%（图B）。根据Cytena Single-Cell Printer与成像仪的图像数据，计算出所有组均达到 >99% 的单克隆源性（图C）。这些结果表明所有组的分选效率高且相当。到第14天，在培养基A和B中，IGF-1共表达细胞的汇合度分别比对照高出35%和24%（图D）。培养20天后，IGF-1共表达细胞的克隆效率显著高于对照细胞：在培养基A中为53.3%（相对于对照增加了 196%，p< 0.001），在培养基B中为 89%（增加了 53%，p< 0.01）（图E）。总的来说，这些结果表明IGF-1共表达显著增强了单细胞增殖和克隆效率，并且在不同培养条件下均表现出稳健的性能。因此，该策略代表了优化生物制药开发中单细胞克隆的一项重大进展。

- 单克隆细胞密度（VCD）提高29–64%； 
- 目标蛋白 P04 产量提升47–89%，主要源于细胞增殖加速而非单位细胞生产率（qP）变化。 

为了研究IGF-1共表达对单克隆细胞生长和蛋白质生产的影响，使用两种培养基（培养基A和培养基B）在125 mL 摇瓶中进行了批次实验。结果表明，在两种培养基中，共表达IGF-1的克隆的平均 VCD 显著高于未共表达IGF-1的克隆，在培养基A中增加了64%（p<0.001），在培养基B中增加了29%（图A, p<0.01）。两组的细胞活力均保持在 >90%（图B），表明IGF-1共表达在维持高活力的同时有效促进了细胞生长。此外，在两种培养基中，共表达IGF-1的克隆的产品产量均显著高于未共表达IGF-1的克隆，在培养基A和B中平均分别增加了89%和47%（图C, p<0.05）。有趣的是，在IGF-1共表达组和非共表达组之间未观察到 qP 的显著差异（图D）。这些结果表明，产品产量的增加可能主要源于细胞生长的增强，而不是 qP 的变化。

共表达克隆的葡萄糖/谷氨酸消耗增加，乳酸积累略有增加（这可能是葡萄糖消耗增加的结果）（见下图），表明IGF-1改善了能量代谢效率。 

4.长期稳定性：

连续培养60代后，蛋白产量波动<15%，关键质量属性（如SEC纯度）及IGF-1转录水平稳定（见下图），符合工业化生产要求。

 
结论

IGF-1共表达是一种高效、稳定的单克隆化策略，能显著克服难表达蛋白对CHO细胞增殖的抑制，提升克隆效率与产量，且不影响长期生产稳定性。结合自动化设备（如Cytena单细胞打印机），该方法可加速高产量细胞株的开发，为生物制药提供可靠解决方案。