摘要

全面的免疫监测需要测量产生不同细胞因子的T细胞频率，以确定细胞介导免疫中Th1、Th2和Th17成分的强度。抗原滴度检测可提供关于T细胞反应亲和力的额外信息。在肿瘤免疫中，建议通过检测多个表位来考虑决定簇扩散效应。进行全面免疫监测需要大量 PBMC 系统运行上述检测，这在大多数检测案例中是受限的。迄今为止，采用ELISPOT检测法的免疫监测已采用96孔板格式进行。本研究显示，通过在膜表面积仅为96孔板三分之一的384孔板中进行检测，可提高细胞利用率。对两种格式中抗原特异性T细胞反应 PBMC 的系统测试表明，384孔板检测相当于96孔板检测的三分之一微型化。在384孔板格式中，允许与抗原呈递细胞充分接触的最低可用细胞数为33,000个 PBMC /孔。因此，通常从1 mL血液中获取的100万个 PBMC ，可在384孔板格式中进行30孔T细胞ELISPOT检测。

1. 引言

T淋巴细胞是机体抵御癌症及各类感染的主要防御细胞。监测T细胞介导的免疫反应面临两大挑战：其一，这些细胞分化为多种效应细胞亚群，分泌不同且通常互斥的效应分子；其二，只有全面评估所有亚群，才能揭示T细胞免疫的真实特性[1]。另一个挑战在于，T细胞常同时靶向多种抗原/肽段，必须对所有抗原进行检测才能准确评估免疫反应强度。抗原效价测定可反映T细胞反应的亲和力。因此，采用ELISPOT技术的全面免疫监测需检测多种分析物及测试条件。临床试验方案通常要求同步进行多项细胞检测，这会增加额外的细胞损耗。理想情况下， PBMC 应冷冻保存以供批量检测，但这会导致更多细胞损失。基于上述原因，受试者可获取的细胞数量往往成为细胞免疫监测的限制因素，尤其在涉及儿童、老年、免疫抑制或肿瘤受试者的试验中更为明显。

目前尚无单一检测方法能全面测量T细胞免疫的所有相关参数。ELISPOT检测可揭示抗原反应性Th1、Th2及Th17细胞的频率与细胞因子特征。通过双色ELISPOT检测（酶联或荧光法）测量IL-2与 IFN - γ 的共表达，可提供与流式细胞术同等灵敏度的多功能T细胞数量信息，但所需细胞数量更少[2]。在体外抗原暴露24小时内检测到产生颗粒酶B（Granzyme B）和穿孔素（Perforin）的T细胞，表明CD8+效应细胞近期在体内被激活[3]。相反，若在体外抗原暴露24小时内未检测到产生颗粒酶B和穿孔素的T细胞，但在后续体外抗原刺激3-4天后检测到这些细胞因子，则提示CD8+记忆细胞在体内处于静息状态，但具有再激活后的细胞溶解潜能[4]。通过滴定测试抗原浓度可揭示T细胞对该抗原的亲和力[5]，此类测量在肿瘤学及自身免疫试验中尤为重要。

在酶标孔板检测中，每个接种的细胞都会被逐一检测。这种检测方式进一步提高了细胞利用率——细胞在检测过程中不受影响地存活，可重复用于后续实验[6,7]。然而， PBMC 数量常成为免疫监测的瓶颈。为减少 PBMC 使用量，近期研究采用了一种新型酶标孔板检测法：先在384孔板和1536孔板中用抗原预激活细胞，再转移至常规96孔酶标孔板中测定细胞因子产生细胞数量[8]。由于此类细胞转移操作易出错且耗时费力，我们验证了是否可通过直接将 PBMC 接种于专用384孔酶标孔板（其膜表面积 PVDF 常规96孔板）来实现检测。需注意的是，这类384孔板的膜表面积仅为常规96孔板的三分之一（按孔数推算应为四分之一）。鉴于酶标孔板检测依赖于单层T细胞的抗原呈递细胞（APC）接触检测，我们推测384孔板检测所需的试剂（包括细胞材料）用量可精确控制在96孔板的三分之一。

2. 实验部分

2.1. 外周血单个核细胞

本研究使用的人源 PBMC 取自健康供体，这些供体选自Cellular Technology Ltd公司的参考数据库[9]。所有供体均经过HLA分型检测，并预先表征了T细胞活性。细胞解冻采用优化方案[10]：将冷冻管置于氮气蒸气中保存，随后放入37°C玻璃珠浴槽中处理10分钟（CTL -BB-001， CTL ，美国俄亥俄州克利夫兰）。使用预热至37°C的 CTL 抗聚集培养基（货号 CTL -AA-005， CTL ，美国俄亥俄州克利夫兰）缓慢稀释细胞。 PBMC 离心10分钟后，弃去上清液，轻敲细胞沉淀使其重悬，再加入抗聚集培养基。使用 CTL 的活/死/凋亡细胞计数平台（货号 CTL - LDAC -100）对细胞样本进行活细胞计数。计数完成后再次离心，将细胞重悬于适量 CTL 检测培养基（货号 CTLT -005， CTL ，美国俄亥俄州克利夫兰），按实验要求接种相应数量的人源 PBMC 。

2.2. 人 IFN - γ ELISPOT检测

384孔和96孔的ELISPOT检测均使用Cellular Technology Ltd.公司的人 IFN - γ 试剂盒（96孔试剂盒货号hIFNG-1M/5,384孔试剂盒货号hIFNG-3M/5）进行。所有抗体、三抗、稀释液和底物均包含在试剂盒中。两种类型的板均按照制造商的说明进行检测。简言之，板在过夜后用人 IFN - γ 包被抗体进行包被。次日，用PBS洗涤板一次，然后将HCMVpp65抗原（货号CEF32-07-005）接种于 CTL -Test培养基中。96孔板接种 PBMC 后需100 µL ，384孔板需33 µL ，随后将板置于37°C、7%二氧化碳的湿润培养箱中。孵育24小时后，移除 PBMC ，并加入试剂盒中的检测抗体和显色试剂。完成ELISPOT检测后，将板置于层流罩中风干，再进行分析。

使用免疫斑点®S6Ultimate阅读器（型号S6ULT9000， CTL ，美国俄亥俄州克利夫兰）对酶标仪斑点板进行扫描分析。免疫斑点®软件通过SmartCount™和Autogate™功能，自动计算每种抗原刺激条件及阴性对照培养基中的斑点形成单位（SFU）[11]。

2.3. PBMC 的荧光检测

PBMC 采用CalceinAM（货号C3100MP，Invitrogen公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）进行染色，具体操作为将1.0×10⁶ PBMC /mL的细胞悬液与含1 µL 1mMCalceinAM染料的DMSO（Sigma公司，美国密苏里州圣路易斯）在 CTL -Test培养基中孵育。孵育结束后，离心10分钟并弃去上清液，随后用 CTL -Test培养基洗涤细胞两次，最终用于实验。

荧光检测使用ImmunoSpot®S6UltimateReader（型号S6ULT9000， CTL ，美国俄亥俄州克利夫兰）完成，激发波长设置为480nm，检测波长采用520±20nm发射滤光片。

3. 结果与讨论

3.1. CD8+细胞来源的 IFN - γ ELISPOT检测显示96孔板与384孔板中细胞大小分布一致

采用CEF肽段池刺激 PBMC 中的CD8+细胞，分别在96孔板和384孔板中平行进行人 IFN - γ 斑点实验。由于384孔板的膜表面积仅为96孔板的三分之一，因此在384孔板中使用的 PBMC 数量及所有其他实验试剂均减少三分之一。图1A、B展示了96孔板和384孔板的代表性孔板图像。肉眼观察显示斑点大小和密度相似，但为更严格比较两种孔板的斑点尺寸，进行了图像分析。96孔板和384孔板的图像采用相同光学分辨率和数字分辨率采集，确保可进行相似比较。两种孔板的斑点尺寸分析均显示为钟形曲线，且均值和离散度相同（图1C、D）。以对数尺度计算，96孔板和384孔板的平均斑点尺寸分别为−2.575和−2.514，标准差分别为0.482和0.411。因此，两种孔板的斑点尺寸等效，证明单个细胞的T细胞分泌活性不受孔板尺寸影响。

图1。

96孔板与384孔板中 IFN γ 的斑点尺寸及分布完全一致。（A，B）分别以相同光学分辨率和数字分辨率拍摄96孔板与384孔板的对应图像；（C，D）将两孔的斑点尺寸以直方图形式呈现，并叠加红色拟合对数正态曲线。

384孔板中的斑点尺寸分布与正态（高斯）函数的钟形曲线高度吻合（图1C、D）。为统计学验证曲线是否符合正态分布，我们采用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫拟合优度检验进行分析，设定显著性水平 α =0.05。96孔板与384孔板的斑点尺寸p值分别为0.419和0.220。由于两个p值均大于0.05的显著性阈值，因此可判定斑点尺寸分布符合正态分布。

建立正常的斑点大小分布至关重要，因为这允许进行客观计数。对于96孔板格式[12]以及384孔板，可通过将最小和最大斑点大小阈值设置为平均斑点大小的3个标准差（SD）来实现基于统计学的自动化大小门控。当斑点大小呈正态分布时，大于平均值3个SD的斑点（具有超过99.7%的置信度）源自细胞簇，需通过估算构成该簇的斑点数量（即分泌分析物的细胞）进行计数。小于平均值3个SD的斑点（具有超过99.7%的确定性）代表检测假象，必须通过门控排除。基于这些门控规则，我们比较了两种板格式获得的斑点计数。

3.2. 在384孔板和96孔板中，均观察到 PBMC 数量与点形成单元（SFU）之间呈线性关系

在96孔板中，斑点数量与细胞数量之间的关系在每孔1.0×10⁵至1.0×10⁶个 PBMC 范围内呈线性关系[13]，但超过或低于该细胞数量范围时线性关系不再成立。为确保T细胞活化及随之产生的细胞因子分泌，T细胞与抗原呈递细胞（APC）必须在细胞膜上形成接触。细胞数量与斑点计数的线性范围表明：当每孔接种少于1.0×10⁵个 PBMC 时，细胞间接触无法实现；而当接种量超过1.0×10⁶个时，细胞开始出现拥挤现象。在这两个极端值之间， PBMC 应能在细胞膜上形成单层结构，从而实现每个抗原特异性T细胞的活化与检测。为验证该假说，我们采用荧光染料对 PBMC 进行染色，并以十倍梯度稀释法将其接种至96孔板中。如图2所示，当每孔接种1.0×10⁴个 PBMC 时，细胞分布过于分散，无法实现细胞间接触；当接种量为1.0×10⁵个时， PBMC 接近形成细胞间接触的临界密度；而当接种量达到1.0×10⁶个时，细胞开始出现过度拥挤，不再维持单层结构。因此，96孔板格式下细胞数量/斑点计数的线性数据与单层假说相符。

图2。

PBMC 经荧光CalceinAM染料染色后，将指定数量的细胞接种至96孔板相应孔中。使用480nm激发波长的ImmunoSpot®S6UltimateReader读板仪进行细胞成像，并通过520±20nm发射波长滤光片检测荧光信号。

若单层假说成立，那么将 PBMC 以相同细胞密度接种至384孔板（即膜孔数为膜孔数三分之一）时，同样会呈现斑点数与细胞数的线性关系，尽管每孔的斑点数仅为膜孔数的三分之一。

为探究384孔板中细胞数量/斑点计数的线性关系，将 PBMC 调整至1.5×10⁷个/mL，并进行12级梯度稀释。将细胞平行接种于96孔板和384孔板中，分别用移液器将细胞悬液 100μL 至96孔板和33 μL 至384孔板。随后采用 HCMV pp65抗原刺激CD8+细胞，进行人 IFN - γ 斑点实验。结果如图3所示：96孔板中，每孔1.0×10⁵个细胞与1×10⁶个细胞之间呈现近乎完美的线性关系（R²=0.9782）；384孔板中，当接种量为上述数值的三分之一时，每孔3.3×10⁴个 PBMC 与3.5×10⁵个细胞之间也呈现近乎完美线性（R²=0.9823）。两种孔板格式中，当细胞密度高于或低于上述数值时，斑点计数与细胞数量的关系开始偏离线性。

图3。

（A，B）PBMC 以指定数量进行连续稀释后接种于酶标仪检测板，加入 HCMV pp65以诱导特异性CD8+细胞产生 IFN - γ 。向(B)384孔板添加的 PBMC 数量为(A)96孔板的三分之一。叠加的红线显示理想线性函数。对于96孔板，实验数据在每孔1.0×10⁵个细胞至1×10⁶个细胞范围内近似符合线性关系（R²=0.9782）；对于384孔板，线性关系在每孔3.3×10⁴个 PBMC 至3.5×10⁵个细胞范围内近似成立（R²=0.9823）。

3.3. 384孔板重复孔中的点计数服从正态分布

根据上述数据，当 PBMC 以相同密度接种时，384孔板的斑点计数应为96孔板的三分之一，即每孔绝对数值的三分之一。由于96孔板重复孔之间存在固有变异性（研究显示其遵循正态分布[14]），要直接比较96孔与384孔板的差异，最佳方法是验证384孔板中重复孔的变异性是否遵循相同规律。此外，重复孔斑点计数的正态分布特性，使我们能够通过参数统计方法比较抗原诱导斑点计数与培养基对照孔的数值，从而确定阳性反应的判定阈值。

PBMC 在384孔板中进行测试，每孔接种5×10⁴个细胞（384个重复孔）和1.0×10⁵个细胞（192个重复孔）。两种情况下均使用 HCMV pp65刺激CD8+细胞。采用Shapiro Wilk检验评估重复孔中的斑点计数是否符合正态分布。根据该检验，两种细胞稀释度的p值分别为0.708和0.388（α =0.05）。由于p值大于显著性水平（α），重复孔中的斑点数量被认为符合正态分布。重复孔实验斑点计数的Q-Q图（图4）呈线性，证实了Shapiro Wilk检验的结果。这证明384孔板重复孔中的斑点计数（如先前96孔板研究[14]所述）遵循正态分布函数。因此，在384孔板和96孔板检测中，均可使用参数统计方法（包括Student‘s检验或方差分析）比较检测结果。这也意味着无需采用经验性截断值（例如96孔板中>10个斑点）来判定阳性与阴性反应孔。既往研究中定义了“最小斑点数”以区分阳性与阴性反应，因为这些细胞无法进行参数统计检验，而参数检验可明确区分二者。

图4。

384孔板重复孔的点计数变异符合正态分布。 PBMC 接种于：(A)384个重复孔，每孔0.5×10⁵个细胞；(B)192个重复孔，每孔1.0×10⁵个细胞。采用 IFN - γ 斑点试验检测 HCMV pp65抗原的反应。通过Shapiro-Wilk检验（α 值0.05，p值分别为0.708和0.388）确认数据正态性。实验计数与理论计数的Q-Q图如图所示。

3.4. 384孔板中的 SFU 仅为96孔板的三分之一

我们采用平行实验设计，对12份不同冷冻保存的 PBMC 样本进行双板格式检测，其中11份样本对 HCMV pp65呈阳性反应。细胞以每孔3×10⁵ PBMC 的密度接种于96孔板（每个孔接种1.0×10⁵个细胞，每孔三复孔），并以三分之一体积（每孔1.0×10⁵个细胞）接种于384孔板（每个孔接种1.0×10⁵个细胞，每孔三复孔）。384孔板实验中，其余试剂用量均按96孔板的三分之一比例使用。所有检测结果均通过包含384孔板计数功能的ImmunoSpot®软件（版本5.3.6）进行统计分析。如表1所示，11位阳性供体的96孔板平均 SFU 数（每孔三个复孔）约为384孔板平均菌落形成单位（SFU）的三倍。当计算11位供体的平均值（三复孔数据的平均值）时，所得结果呈现近乎完美的1:3比例关系。

表1。

96孔板格式的斑点计数约为384孔板格式的三倍。对于11名受试者，HCMVpp65诱导的反应在每种板格式中均进行三次重复孔测定，并显示三次重复斑点计数的平均值。96孔板格式与384孔板格式的平均斑点计数比值显示于右侧列。

3.5. 96孔板与384孔板格式中观察到匹配的剂量反应曲线

为应对可用测试样本 PBMC 有限的问题，免疫监测工作主要依赖单次抗原剂量下的T细胞反应检测。然而，此类检测无法获取T细胞对抗原功能亲和力的关键信息，而该信息可通过抗原系列稀释检测来确定[5]。鉴于384孔板格式可使细胞使用量降低三倍，将亲和力检测纳入T细胞监测检测中应成为可能。

我们测试了在96孔板和384孔板中进行的T细胞功能亲和力测量是否会产生相同的结果。将 PBMC 以每孔3×10^5个细胞的密度接种到96孔板中，以每孔1.0×10^5个细胞的密度接种到384孔板中。 HCMV pp65抗原的滴定范围从10 µg /mL降至每孔1.0×10^-6 µg 。如图5所示，两种板型的剂量反应曲线是平行的。曲线在96孔板中达到约360个斑点/孔，在384孔板中达到约105个斑点/孔。因此，96孔板中50%最大刺激的值为180个斑点/孔，384孔板中为53个斑点/孔。达到50%最大刺激的抗原浓度代表Keff50值，定义了亲和力。两种孔板格式的Keff50值几乎相同，均为7.5ng/mL。数据显示，384孔板检测在测量T细胞功能亲和力方面与96孔板检测同样有效，但仅需三分之一的细胞数量。

图5。

在384孔和96孔板格式中进行的T细胞功能亲和力测量结果相同。通过 PBMC 检测了96孔和384孔板中CD8+细胞对 HCMV 肽pp65诱导的 IFN - γ 产生。测试的最高肽浓度为10 μg/mL，随后进行1:10系列稀释。96孔板中接种的 PBMC 数量为3×10^5/孔（绿线），384孔板中为1×10^5/孔（蓝线）。最大激活50%的位置用红色X标记。

当抗原进行系列稀释时，通常无需设置重复孔，因为连续抗原浓度的系列孔可确认阳性反应。384孔板格式的功能亲和力测定，所需 PBMC 量可与常规96孔板单次抗原剂量测定相同或更少。在常规96孔板检测中，单次抗原剂量下以每孔3×10⁵ PBMC 进行三重复孔抗原反应性测试，需9×10⁵ PBMC 外加等量培养基对照 PBMC（即1.8×10⁶ PBMC）。而在对应的384孔板格式中，细胞接种密度为每孔1.0×10⁵个；使用1.8×10⁶ PBMC 时，可额外设置15个孔用于剂量反应曲线测试（其中3个孔分配给培养基对照），从而获取关于T细胞反应亲和力的宝贵补充信息。

3.6. 384孔板检测的信噪比性能较低

现有数据显示，在384孔板格式的酶联免疫斑点试验中， PBMC 和试剂每减少三分之一，抗原诱导的斑点计数（即信号强度）会按比例减少三分之一。由于酶联斑点数据的解读依赖于信噪比（培养基背景值），我们比较了两种板格式的这一指标。我们平行测试了三种不同冷冻保存的 PBMC 样本，这些样本先前已被确认在两种孔板格式中分别对 HCMV pp65抗原产生高、中、低反应。与先前结果一致，384孔板中抗原诱导的 SFU 数量是96孔板中 SFU 数量的三分之一（图6）。然而，我们在96孔板和384孔板的中等对照孔中观察到相似数量的 SFU ，该数量在三位供体中介于1至4个斑点之间。96孔板的信噪比平均比384孔板高2.8倍（分别为2.3倍、3.6倍和2.6倍）。在尝试识别弱T细胞反应时，必须考虑384孔板较低的信噪比性能。提高信噪比的一种方法是：对于弱反应样本，从 PBMC 群体中纯化CD8细胞并使用纯化的CD8细胞而非 PBMC 。CD8细胞可相互呈递抗原，因此无需额外的非分泌性抗原呈递细胞（APC）。通常情况下，CD8细胞约占 PBMC 的25%，因此当接种细胞数量相同时，信号强度可提升四倍。此外，由于实验中不存在旁观细胞，背景干扰也会降低，从而进一步提高信噪比。

图6。

96孔板与384孔板的信噪比性能对比。图中展示了 HCMV pp65抗原诱导反应（斜线柱状图）及培养基对照（实心柱状图——多数因尺寸过小无法显示）在三位供体高、中、低反应水平下的表现。96孔板 PBMC 数为3×10⁵，384孔板为1.0×10⁵。各条件下三个重复孔的平均斑点计数/孔值标注于柱状图上方。刺激指数（SI）定义为抗原诱导的ELISPOT数除以培养基背景中的斑点数。对应培养基对照/抗原配对的SI值已明确标注。

3.7. 384孔板低点计数的变异系数高于96孔板对应孔位

在酶标免疫分析中，稀有抗原特异性T细胞会在大量旁观细胞中被识别。因此，可以预期变异系数（CV：重复样本间的孔间变异性）会随着测试样本中特异性T细胞数量的减少而增加。换言之，给定测试样本中抗原特异性T细胞的频率越低，该样本体积在重复孔中移液时此类细胞的变异性就越高。同样可以预测，在相同低浓度抗原特异性细胞条件下，当样本体积较小时，孔间变异性会更高。由于96孔板中接种了100 μL PBMC 样本，而384孔板中接种了33 μL 相同浓度的 PBMC ，因此384孔板的CV应更高。

为验证这些预测，我们采用人类 IFN - γ 斑点实验：用四种抗原刺激三名供体的 PBMC ，同时将 PBMC 按线性范围连续稀释以获得广泛的斑点计数分布。每个细胞样本和抗原稀释度均进行四重复孔实验。图7显示，计算每个复孔的变异系数（CV）并绘制其与该复孔平均斑点数的关系曲线。两种板型中， SFU 较少的孔位CV值均高于 SFU 较多的孔位。96孔板对应孔位的CV值低于384孔板。在384孔板格式下检测低频抗原特异性T细胞样本时，这一特性同样需要纳入考量。

图7。

在检测低频T细胞时，384孔板中重复孔的斑点计数变异度高于96孔板。对三位供体的 PBMC 进行连续稀释检测，每个供体和细胞稀释度均设置四个重复孔，以评估抗原诱导的 IFN - γ 反应。96孔板中 PBMC 以每孔1.0×10⁶至1.0×10⁵个细胞的连续稀释度接种，384孔板中则以每孔3×10⁵和3×10⁴个细胞的稀释度接种。将四个重复孔的变异系数（CV）与对应检测结果的平均斑点数进行绘图。

4. 结论

采用常规96孔板进行的酶联斑点试验（ELISPOT）相比其他T细胞监测技术，其细胞利用率已显著提升。通过引入384孔板ELISPOT检测，我们成功将所需 PBMC 数量减少三分之二，这与384孔板膜表面积减少三倍的特性相匹配。系统性对比两种检测方式发现：384孔板中抗原诱导的斑点计数（每孔 PBMC 数量仅为常规的三分之一）仅为96孔板的三分之一。因此，384孔板可便捷检测高频和中频抗原特异性T细胞。但针对低频T细胞，由于铺板 PBMC 减少，刺激指数降低和重复样本间变异系数（CV）升高成为必然结果。在384孔板低频检测中，增加重复孔数可弥补分辨率不足。由于384孔板重复孔的ELISPOT计数服从正态分布，可采用学生t检验和方差分析等参数检验来识别阳性反应。这对弱反应尤为重要，因为增加重复孔数能以更高统计学显著性区分弱反应与阴性反应。