原代细胞的组织分离制备方法与操作流程
2026-01-21 来源:本站 点击次数:89
原代细胞是指直接从生物体（如人或动物）的组织、器官或胚胎中取出，在体外进行首次培养的细胞。由于它们离体时间短，遗传背景和生物学特性更接近体内状态，因此在药物测试、疾病机制研究等领域具有极高价值。然而，体内组织中的细胞通过细胞间质（如胶原蛋白、纤维等）紧密结合，无法直接用于培养，必须经过专门处理将其分散为单个细胞或小细胞团，这一过程即为“分离”或“制备”。
分离方法详解
根据组织来源和物理特性的不同，主要采用以下几种策略：
1、悬浮细胞的分离 此类材料本身已是液体悬液，无需复杂的消化步骤。
适用对象：血液、骨髓、羊水、胸水、腹水等含有游离细胞的体液。
基本流程：
将采集的悬液转移至离心管中。
采用低速离心（通常为1000 rpm，持续5-10分钟）使细胞沉淀。
小心吸弃上清液（可能含有血浆、碎片等）。
用无钙、镁离子的PBS缓冲液洗涤沉淀1-2次，以去除残留的抗凝剂或杂质。
最后用完全培养基重悬细胞，调整至合适的浓度后即可接种培养。
进阶技巧：若需从混合细胞群中富集特定细胞（如淋巴细胞），可利用密度梯度离心法（如Ficoll分层液），利用不同细胞比重的差异实现分离。
2、实体组织的机械分散法 这是一种物理手段，通过剪切力破坏组织结构。
适用对象：纤维成分少、质地较软的组织，如脑组织、部分胚胎组织或某些肿瘤组织。
基本流程：
将组织块用PBS反复冲洗，去除血液和脂肪。
用锋利的手术剪或眼科剪将组织剪切成尽可能细小的碎片（约1mm³）。
通过以下方式进一步分散：
吸管吹打：用带有狭窄口径的移液管反复吹吸组织悬液。
筛网过滤：将剪碎的组织置于不锈钢纱网上，用注射器钝端或玻璃棒轻轻压挤，迫使细胞通过网孔。
优缺点：优点是操作简单、快速，且避免了酶对细胞的潜在毒性；缺点是对组织损伤较大，细胞得率和存活率相对较低，且难以获得完全的单细胞悬液，常伴有细胞团块。
3、实体组织的消化分离法 这是最常用、最有效的方法，尤其适用于富含结缔组织的坚硬器官。
适用对象：肝脏、肾脏、皮肤、心脏、肿瘤组织以及上皮组织等。
核心原理：利用生化酶特异性降解细胞间的桥连物质（主要是蛋白质），使组织膨松、解离。
关键酶类及应用：
胰蛋白酶 (Trypsin)：
作用机制：一种蛋白水解酶，主要切割赖氨酸或精氨酸残基之间的肽键，能有效水解多种细胞间质蛋白。
适用场景：对细胞间质较少的软组织效果好，如肝、肾、甲状腺、胚胎组织等。
关键条件：活性最强的pH为7.6-8.0，温度为37℃。必须使用不含钙、镁离子的缓冲液（如PBS）配制，因为这些离子会抑制其活性。浓度过高或消化时间过长会损伤细胞膜，导致细胞死亡。
胶原酶 (Collagenase)：
作用机制：由细菌产生，能特异性地水解胶原蛋白——这是结缔组织的主要成分。它对细胞本身的损伤很小，能较好地保持细胞膜的完整性。
适用场景：是处理纤维性组织、含丰富胶原的硬组织（如乳腺、滑膜、骨、软骨）以及实体瘤的首选。即使在有血清（含抗胰蛋白酶因子）的环境中仍能保持活性，使用更方便。
类型选择：市面上有I、II、IV、V等多种类型，针对不同组织有不同的效率，例如IV型常用于胰腺、肝脏等。
辅助酶：为了获得更高纯度和活力的细胞，常与其他酶联用：
透明质酸酶 (Hyaluronidase)：降解透明质酸，提高组织通透性，常与胶原酶联用。
脱氧核糖核酸酶Ⅰ (DNase I)：分解细胞破裂后释放出的DNA，防止其形成粘稠网络导致细胞凝集，从而提高细胞悬液的均一性。
螯合剂 (EDTA)：非酶物质，通过螯合Ca²⁺和Mg²⁺离子，削弱依赖这些离子的细胞间连接（如钙黏蛋白），常与胰蛋白酶协同使用以增强消化效果。
基本流程：
组织经PBS清洗并剪碎成小块（1-4 mm³）。
加入适量的酶溶液（如0.1%-0.25%胰蛋白酶或1-2 mg/mL胶原酶）。
置于37℃水浴或摇床中孵育，期间可轻柔摇晃以促进消化。
消化时间依组织类型和酶浓度而定，需在显微镜下观察，当组织块变得透明、絮状时，即表示消化充分。
加入含血清的培养基（血清可抑制胰蛋白酶活性）终止消化反应。
通过80-200目的细胞滤网过滤，去除未消化的组织块。
离心收集细胞沉淀，用培养基洗涤后重悬，计数并接种。
特殊案例：原代肝细胞的两步灌注法
对于像肝脏这样的大器官，为了获得高产量和高活性的肝细胞，经典方法是两步胶原酶灌注法（Seglen法）
原理：不是直接浸泡，而是将胶原酶溶液通过门静脉系统直接灌注到整个肝脏的血管网络中，从内部均匀地消化肝细胞间的基质，使肝实质细胞得以完整地释放出来。
优势：相比直接消化法，这种方法对细胞的机械损伤极小，细胞得率和存活率都非常高，是制备原代肝细胞的“金标准”。
结论及建议
原代细胞的成功制备是实验的关键第一步。核心在于根据组织特性“精准匹配”分离方法：液体样本首选离心；软组织可用机械法或温和的酶消化；而硬组织、富含胶原的组织则必须依赖胶原酶等特异性消化酶。无论采用何种方法，都必须严格遵循无菌操作，控制好消化时间、温度和pH，动作轻柔，以最大限度地保护细胞活性。
分离方法详解
根据组织来源和物理特性的不同，主要采用以下几种策略：
1、悬浮细胞的分离 此类材料本身已是液体悬液，无需复杂的消化步骤。
适用对象：血液、骨髓、羊水、胸水、腹水等含有游离细胞的体液。
基本流程：
将采集的悬液转移至离心管中。
采用低速离心（通常为1000 rpm，持续5-10分钟）使细胞沉淀。
小心吸弃上清液（可能含有血浆、碎片等）。
用无钙、镁离子的PBS缓冲液洗涤沉淀1-2次，以去除残留的抗凝剂或杂质。
最后用完全培养基重悬细胞，调整至合适的浓度后即可接种培养。
进阶技巧：若需从混合细胞群中富集特定细胞（如淋巴细胞），可利用密度梯度离心法（如Ficoll分层液），利用不同细胞比重的差异实现分离。
2、实体组织的机械分散法 这是一种物理手段，通过剪切力破坏组织结构。
适用对象：纤维成分少、质地较软的组织，如脑组织、部分胚胎组织或某些肿瘤组织。
基本流程：
将组织块用PBS反复冲洗，去除血液和脂肪。
用锋利的手术剪或眼科剪将组织剪切成尽可能细小的碎片（约1mm³）。
通过以下方式进一步分散：
吸管吹打：用带有狭窄口径的移液管反复吹吸组织悬液。
筛网过滤：将剪碎的组织置于不锈钢纱网上，用注射器钝端或玻璃棒轻轻压挤，迫使细胞通过网孔。
优缺点：优点是操作简单、快速，且避免了酶对细胞的潜在毒性；缺点是对组织损伤较大，细胞得率和存活率相对较低，且难以获得完全的单细胞悬液，常伴有细胞团块。
3、实体组织的消化分离法 这是最常用、最有效的方法，尤其适用于富含结缔组织的坚硬器官。
适用对象：肝脏、肾脏、皮肤、心脏、肿瘤组织以及上皮组织等。
核心原理：利用生化酶特异性降解细胞间的桥连物质（主要是蛋白质），使组织膨松、解离。
关键酶类及应用：
胰蛋白酶 (Trypsin)：
作用机制：一种蛋白水解酶，主要切割赖氨酸或精氨酸残基之间的肽键，能有效水解多种细胞间质蛋白。
适用场景：对细胞间质较少的软组织效果好，如肝、肾、甲状腺、胚胎组织等。
关键条件：活性最强的pH为7.6-8.0，温度为37℃。必须使用不含钙、镁离子的缓冲液（如PBS）配制，因为这些离子会抑制其活性。浓度过高或消化时间过长会损伤细胞膜，导致细胞死亡。
胶原酶 (Collagenase)：
作用机制：由细菌产生，能特异性地水解胶原蛋白——这是结缔组织的主要成分。它对细胞本身的损伤很小，能较好地保持细胞膜的完整性。
适用场景：是处理纤维性组织、含丰富胶原的硬组织（如乳腺、滑膜、骨、软骨）以及实体瘤的首选。即使在有血清（含抗胰蛋白酶因子）的环境中仍能保持活性，使用更方便。
类型选择：市面上有I、II、IV、V等多种类型，针对不同组织有不同的效率，例如IV型常用于胰腺、肝脏等。
辅助酶：为了获得更高纯度和活力的细胞，常与其他酶联用：
透明质酸酶 (Hyaluronidase)：降解透明质酸，提高组织通透性，常与胶原酶联用。
脱氧核糖核酸酶Ⅰ (DNase I)：分解细胞破裂后释放出的DNA，防止其形成粘稠网络导致细胞凝集，从而提高细胞悬液的均一性。
螯合剂 (EDTA)：非酶物质，通过螯合Ca²⁺和Mg²⁺离子，削弱依赖这些离子的细胞间连接（如钙黏蛋白），常与胰蛋白酶协同使用以增强消化效果。
基本流程：
组织经PBS清洗并剪碎成小块（1-4 mm³）。
加入适量的酶溶液（如0.1%-0.25%胰蛋白酶或1-2 mg/mL胶原酶）。
置于37℃水浴或摇床中孵育，期间可轻柔摇晃以促进消化。
消化时间依组织类型和酶浓度而定，需在显微镜下观察，当组织块变得透明、絮状时，即表示消化充分。
加入含血清的培养基（血清可抑制胰蛋白酶活性）终止消化反应。
通过80-200目的细胞滤网过滤，去除未消化的组织块。
离心收集细胞沉淀，用培养基洗涤后重悬，计数并接种。
特殊案例：原代肝细胞的两步灌注法
对于像肝脏这样的大器官，为了获得高产量和高活性的肝细胞，经典方法是两步胶原酶灌注法（Seglen法）
原理：不是直接浸泡，而是将胶原酶溶液通过门静脉系统直接灌注到整个肝脏的血管网络中，从内部均匀地消化肝细胞间的基质，使肝实质细胞得以完整地释放出来。
优势：相比直接消化法，这种方法对细胞的机械损伤极小，细胞得率和存活率都非常高，是制备原代肝细胞的“金标准”。
结论及建议
原代细胞的成功制备是实验的关键第一步。核心在于根据组织特性“精准匹配”分离方法：液体样本首选离心；软组织可用机械法或温和的酶消化；而硬组织、富含胶原的组织则必须依赖胶原酶等特异性消化酶。无论采用何种方法，都必须严格遵循无菌操作，控制好消化时间、温度和pH，动作轻柔，以最大限度地保护细胞活性。
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