实验前需确定样本中是否表达目的蛋白。
通常会参考文献或数据库进行样本的选择，常用的数据库如下：

（1）网址：https://www.proteinatlas.org/，简称 HPA 数据库，提供人类蛋白质在组织和细胞系中的表达和定位信息。

（2）网址：https://www.phosphosite.org/，蛋白质翻译后修饰数据库，查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。

（3）网址：http://biogps.org/，可以查询人、小鼠、大鼠中某种蛋白的 mRNA 表达水平。

编码蛋白的基因在表达以后，通常还需不同翻译后修饰（post-translation modifications, PTMs）如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化等，才能获得正常的结构与功能。这些翻译后修饰过程受多种修饰酶和去修饰酶等的严格调控，使得蛋白在特定瞬间或时期背景下呈现持续稳定或动态可逆的功能状态。

在进行蛋白检测（如 WB）时，如果蛋白存在翻译后修饰，结果可能会出现分子量大小与预期理论值不符、条带弥散、多条带或条带较弱等情况。如糖基化修饰通常会导致蛋白表观分子量大于预测值。

在蛋白提取和检测过程中，为了最大程度保留目标蛋白的天然修饰状态并避免降解，实验操作中应加入蛋白酶抑制剂（防止蛋白被内源性蛋白酶降解）以及磷酸酶抑制剂（防止已存在的磷酸化修饰被去除），必要时还可根据研究对象选择相应的去乙酰化酶抑制剂或其他特异性抑制剂（如激酶抑制剂）。抑制剂添加能够有效保证目标蛋白的稳定性与修饰完整性，从而获得更准确的检测结果。

常用查询数据库网址：https://www.uniprot.org/，可查询目的蛋白的基因名、别名、功能、可变剪切体、亚细胞定位及可能的翻译后修饰类型等信息，为实验设计与结果分析提供参考。

通过数据库/文献查询靶蛋白是否有异构体以及可变剪切体。如果存在，此类结构差异可能导致 WB 实验中出现多条蛋白条带。为避免遗漏重要信息，建议首次实验时尽量保留完整膜片进行检测。

目的：细胞裂解是蛋白样本制备的关键环节，目的是释放细胞内的蛋白质，以便后续检测。

• 对于贴壁细胞：用 4℃ 预冷的 PBS Buffer (1×) 洗 2~3 遍，用细胞刮刀刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽可能吸尽上清，留下细胞沉淀备用。细胞样品按 1×10⁶ 细胞数加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min（或冰上裂解 5 min，超声仪冰浴超声 20 s）。

• 对于悬浮细胞：用 PBS 洗 2~3 遍，离心收集细胞，尽可能吸尽上清，留下细胞沉淀备用。细胞样品按 1×10⁶ 细胞数加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min（或冰上裂解 5 min，超声仪冰浴超声 20 s）。

• 对于组织样品：剪取适量组织和蛋白裂解液于匀浆器中磨匀（0.01 g 组织加上 50-100 μL 的蛋白裂解液），直至看不见组织块。将组织样品匀浆液转移至 1.5 mL EP 管中，置于冰上蛋白裂解 15 min。12000 rpm，4℃ 离心 10 min，立即吸取上清至一预冷的 1.5 mL EP 管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开；在 DNA 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，DNA 呈双链状态泳动，其迁移率会受碱基组成和序列的影响。

在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于加入了变性剂——蛋白质变性剂常为 SDS（SDS-PAGE），核酸变性剂常为尿素、甲酰胺等，故其分离仅依据于分子量大小。

在高电压的作用下，所有孔道中的蛋白会同时开始向下迁移，分子量大的蛋白，阻力大，位置靠上，分子量小的蛋白则靠下，示意图如下：

根据实验需求和蛋白特性，选择合适的 SDS-PAGE 蛋白质上样缓冲液制备还原样本或非还原样本，以满足不同实验设计的分析要求。

尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致，空置的泳道用等体积的 1× 上样缓冲液补齐，以避免由于凝胶受力不均而导致最后的一两个样品条带出现上扬现象。

目的：蛋白质经 SDS-PAGE 分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作。

目前常用的膜有 PVDF 膜和 NC 膜，其主要区别如下：