一、研究背景：核仁素作为成像靶点的挑战与需求
核仁素（Nucleolin，NCL）是一种多功能核蛋白，其在细胞核仁、细胞质及细胞膜上均有分布，并参与调控rRNA合成、细胞周期进程、细胞增殖与凋亡等关键生物学过程。在多种肿瘤细胞中，核仁素呈现显著过表达，并常易位至细胞膜表面，成为肿瘤特异性诊断和靶向治疗的重要潜在标志物。然而，传统的核仁素检测方法（如免疫印迹、免疫荧光染色）通常依赖细胞裂解或固定，难以实现活细胞内核仁素的原位、实时、动态监测。因此，开发一种能够在单细胞水平上对核仁素进行高灵敏度、高特异性、亚细胞定位动态追踪的活细胞成像工具，对于理解其在生理病理过程中的功能、以及推动基于核仁素的精准诊疗策略至关重要。

二、核心工具：Biotinylated Nucleolin/NCL His&Avi Tag 蛋白在探针构建中的关键作用
在开发新型靶向成像探针的过程中，获得高纯度、结构完整且便于偶联的功能性靶标蛋白是验证探针性能的基石。Biotinylated Nucleolin/NCL His&Avi Tag 蛋白 是一种理想的研究工具，其设计融合了三种关键标签/修饰：
1. 双亲和标签：His标签（多组氨酸）便于通过金属螯合层析进行高纯度、高回收率的蛋白纯化；Avi标签则允许在体外进行位点特异性的生物素化。
2. 高效生物素化：预生物素化的蛋白可通过其生物素（Biotin）与链霉亲和素（Streptavidin）之间高达皮摩尔级的超强非共价结合，实现与各类载体（如纳米颗粒、荧光染料、磁珠）的快速、稳固且取向可控的偶联。
3. 功能验证：该重组蛋白保留了核仁素的关键结构域，可作为标准品用于验证核酸适配体（如AS1411）或抗体与核仁素的特异性结合能力、亲和力（如通过SPR或ELISA），并可用于竞争性结合实验以评估探针的特异性。

因此，在研究初期，利用Biotinylated Nucleolin/NCL His&Avi Tag 蛋白 能够高效、标准化地评估和优化靶向配体（如AS1411适配体）的偶联效率与结合活性，为后续构建高性能纳米探针提供可靠的前期验证。

三、智能"信号增强"型荧光纳米探针的设计与性能
基于上述工具与策略，研究团队成功构建了一种用于原位监测核仁素的智能荧光纳米探针。
1. 探针设计原理：该探针以金纳米颗粒（AuNPs）为载体，在其表面修饰了特异性识别核仁素的核酸适配体AS1411，并连接了荧光报告分子。其核心创新在于“信号增强”机制：当探针未结合靶标时，荧光分子因受AuNPs表面能量转移效应而处于淬灭状态（“关闭”）；一旦AS1411与细胞表面或内部的核仁素结合，探针构象发生改变或与靶标蛋白的距离拉近，能量转移被阻断，荧光信号显著恢复（“开启”），从而实现高信噪比的检测。
2. 优异的分析性能：研究证实，该探针具有良好的单分散性、稳定性、以及优异的靶向特异性。在体外测试中，其荧光强度与核仁素浓度在4-21 nM范围内呈良好的线性关系，并能有效区分核仁素与多种常见细胞内物质。通过调控纳米颗粒尺寸，探针可被设计为分别靶向细胞膜或细胞核区域，实现了对核仁素亚细胞定位分布的精确解析。

四、在细胞焦亡模型中的应用：动态监测与选择性识别
为验证探针在复杂生物学过程中的应用价值，研究者将其应用于电刺激诱导的细胞焦亡模型。
1. 动态监测能力：利用该荧光纳米探针，研究团队在单细胞水平上实时、原位监测了癌细胞（MCF-7）与正常细胞（MCF-10A）在电刺激前后核仁素表达水平与亚细胞分布的动态变化。结果清晰显示，癌细胞中核仁素表达显著高于正常细胞，且随着电刺激电压增加（诱导焦亡），癌细胞内核仁素表达水平，尤其是在细胞核内，呈现显著下调趋势；而正常细胞中的变化则相对微弱。
2. 选择性识别与潜在应用：该工作同时发现，特定电压（如1.0 V）的电刺激能选择性地诱导癌细胞发生焦亡，而对正常细胞影响较小。结合该核仁素探针的成像，提供了一种可能用于选择性识别并监测癌细胞特异性死亡过程的分子影像学方法。

一种基于双功能核仁素蛋白的“信号增强”型荧光纳米探针用于单细胞成像研究