包涵体（Inclusion Bodies, IBs）是外源基因在原核生物（如大肠杆菌）中高效表达时，形成的由错误折叠或未折叠蛋白质聚集而成的、具有较高密度的沉淀，缺少生物活性。

包涵体的核心特征：
- 形态：显微镜下呈圆形或不规则颗粒，直径0.2-1.5μm
- 成分：目标蛋白占比60%-90%，混有少量宿主蛋白、核酸、脂类
- 性质：水溶性差、密度大、抗蛋白酶降解、活性低

作为纯化新手遇到包涵体常常是令人头疼的问题，那么为什么会形成包涵体呢？
包涵体的形成主要是外源蛋白在原核系统中“过度表达”与“折叠滞后”的矛盾导致聚集：
1、表达速度过快：核糖体合成蛋白的速度远超分子伴侣辅助折叠的速度；
2、环境不匹配：原核生物缺乏真核蛋白折叠所需的修饰系统（如糖基化）及氧化还原环境；
3、序列特性：目标蛋白本身含较多疏水氨基酸，易发生分子间疏水相互作用；
4、培养条件：高温、高诱导剂浓度、营养缺乏等胁迫因素加剧聚集；

包涵体的形成并非全然是弊端，一方面它降低了外源蛋白对宿主细胞的毒性，避免了蛋白酶对其的快速降解，有利于积累大量目标产物；另一方面也为后续纯化提供了便利，通过离心即可将包涵体与可溶性杂质有效分离。只要经过合理的变复性处理，部分蛋白仍能恢复活性。

如果您的蛋白形成了包涵体，那可以从两个方面来考虑：1、通过优化前期质粒构建和蛋白表达的条件，减少包涵体的形成。2、通过有效的变性和复性的过程，使包涵体变为活性可溶状态进行纯化。

一、前期质粒构建和蛋白表达条件优化
生长速率的降低通常会促进更多的可溶性表达，从而降低形成包涵体的倾向。对培养条件进行一些简单的修改，降低生长速度或表达速度，优化可溶性表达。缺点是重组蛋白的总产量也可能因此减少。

优化方式可以从以下3点进行考虑：
（1）通过将生长温度降低到20°C到30°C之间，可以降低生长速率。对于在诱导启动子控制下表达的蛋白质，也可以通过改变诱导条件来降低表达率。在较低的细胞密度下诱导(A600 = 0.5)，减少诱导时间，使用较低浓度的诱导剂（例如，0.1 mM IPTG）诱导等。
（2）使用促溶标签，例如GST和麦芽糖结合蛋白（MBP）标签，可以提高目标蛋白的溶解度。
（3）与伴侣蛋白共表达，协助目标蛋白正确折叠分子伴侣的主要特性是它们能够结合未折叠或部分折叠的多肽，从而有效地抑制聚集。例如GroEL/ES和DnaK和蛋白二硫异构酶（PDI）共表达。

二、包涵体纯化
包涵体纯化主要包括以下步骤：质粒构建和蛋白表达，细胞收集和破碎，包涵体分离，蛋白重溶，蛋白复性，蛋白纯化。

1、包涵体分离和清洗
通过离心分离包涵体是一个高效的纯化步骤，因为目标蛋白通常是包涵体的主要成分。DNA、细胞膜和细胞碎片与包涵体大小相同，在离心过程中可能与包涵体共沉。通常采用高压均质或超声的方法破碎细胞。建议使用高压均质（例如，2万psi进行3轮）来减小细胞碎片的大小，以便在离心过程中更容易与包涵体分离。

细胞破裂后，添加DNase（10 μg/mL DNase I, 3 mM MgCl2, 30 min, 25°C）可以减少宿主DNA的量，添加去垢剂（例如，2% Triton X-100）可以减少脂质和膜蛋白。高盐浓度（如0.5 M NaCl）的存在有助于溶解杂蛋白。室温孵育30分钟后，可通过离心（25,000g， 30 min，4°C）收获包涵体沉淀。

离心之后需要对包涵体进行洗涤，以进一步去除杂质。洗涤缓冲液可以使用含有1% Triton X-100和20 mM EDTA的PBS， pH 7.4，在10 000至30 000 × g下离心10至30分钟。去除上清，用相同的缓冲液悬浮和洗涤两次，并在10000-30000 × g离心10 ~ 30min。收集含有包涵体的沉淀。

在一些已发表的方案中，在洗涤缓冲液中加入低浓度的变性剂（例如1-2 M尿素）或更高浓度的NaCl可以提高洗涤效率。

2、包涵体的重溶
包涵体重溶一般使用尿素和盐酸胍，其他的选择包括使用SDS (10%)， n -月桂酰肌氨酸，或其他洗涤剂和极端pH值。建议使用6-8M尿素和盐酸胍作为初始尝试，重溶的条件见下图：

3、包涵体的复性
在溶解之后，蛋白质必须适当地重新折叠以恢复功能。这是通过去除变性剂来完成的，以允许蛋白质折叠并形成正确的分子内结合。成功复性的秘诀在于促进蛋白正确折叠并抑制蛋白聚集。

因此，必须根据经验确定特定蛋白质的合适复性条件。通常需要对一些参数进行优化：

（1）温度
温度是影响复性的一个重要参数。在大多数情况下，在较低的温度下可以得到较高的复性产率和较少的聚集。低温降低了折叠速度和疏水相互作用，而高温时蛋白容易聚集。

到目前为止，还没有任何一个普遍的最佳温度用于不同蛋白的复性。大部分蛋白在接近室温的情况下进行复性过程。

（2）溶液PH
溶液的pH值也是复性的一个重要的因素。所有蛋白质都有一个特征的pH范围，在这个范围内它们可以有效折叠并达到活性状态。

大多数蛋白质在pH值5-9的范围内进行复性，并且在pH值8-8.5时达到最佳复性条件。可以尝试使用高于目标蛋白等电点至少一个pH单位的pH值。

对于含有二硫键的蛋白质，碱性pH值对于二硫键的形成和重组是必要的。

（3）缓冲液添加剂
缓冲液添加剂被认为是通过抑制聚集（尿素或盐酸胍）或增强折叠（精氨酸、甘油、盐）来帮助蛋白正确复性。

精氨酸会破坏非天然构象的稳定性。甘油和糖（蔗糖、甘露醇、山梨醇和海藻糖）：甘油在许多情况下是一种很好的再折叠添加剂，通常在5-30%的范围内使用。

（4）蛋白含有较多的二硫键
如果蛋白有二硫键，在重溶过程中需要添加还原剂（例如，1至10mM DTT)。在复性时，用二硫交换试剂去取代还原剂。加入二硫交换试剂（一组氧化-还原对，例如，氧化+还原谷胱甘肽（GSSG+GSH）或半胱胺+胱胺）以提供合适的氧化还原电位。

常用的复性方法有常规的稀释和透析的方法，或者使用层析柱例如凝胶过滤层析，亲和层析，离子交换层析等进行柱上复性。不同的复性方法的优缺点如下图：

（1）稀释和透析
最常用的方法是在大体积的复性缓冲液中稀释变性蛋白（通常为100倍）。在稀释过程中必须充分的搅拌，以防止分子间相互作用和聚集。可以将蛋白浓度调整为1mg/ml，快速的稀释或者缓慢将包涵体添加到复性缓冲液中。

透析的方法是指使用限定截留分子量的膜进行透析。由于膜的截留分子量远低于目标蛋白，因此目标蛋白被膜保留，而缓冲液交换促进蛋白复性。

（2）使用凝胶过滤层析进行柱上复性
分子筛可以有效限制蛋白聚集，凝胶过滤层析对过程中可能连续形成的聚集体的不断去除是高再复性收率的关键。

使用重溶缓冲液到复性缓冲液的递减梯度平衡色谱柱。然后用复性缓冲液来洗脱蛋白质。将蛋白质逐渐转移到无变性的环境中。

（3）使用亲和层析进行柱上复性
亲和层析柱上复性可以防止在随后的变性剂去除过程中聚集。亲和层析的另一个优点是，只要不超过介质的结合能力，就没有样品体积的限制。

具有较大亲和标签例如GST，MBP标签通常不适合柱上复性。缓冲液中的变性剂会破坏标签和填料的结合。His和Strep标签可以在变性的条件下纯化。使用不含有变性剂的复性缓冲液（例如：20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5 mM imidozole,1 mM 2-mercaptoethanol,pH 8.0

）平衡层析柱，进行上样，然后用平衡缓冲液复性，然后用高浓度咪唑进行洗脱（例如：20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,0.5M imidozole,1 mM 2-mercaptoethanol,pH 8.0）。

（4）使用离子交换层析进行柱上复性
变性蛋白溶液中含有高浓度变性剂或者盐离子不适合使用离子交换。可以使用阴离子或者阳离子进行柱上复性。

如果使用常规的稀释或者透析法进行蛋白复性，可以继续使用以下产品对蛋白进行进一步纯化。