本文来源于微信公众： Cell Culture     作者： 犹八
（一）In vivo CAR-T VS In vitro CAR-T 治疗优势
体外与体内 CAR-T 细胞疗法的比较:
（1）制备工艺：In vivo CAR-T 的制造技术与GMP更加兼容，成本低廉，管理流程简单，避免了繁琐的制备流程，稳定、好用，可大规模生产的特点;
（2）临床应用：现货型产品，避免“一患一制”，快速交付，提高患者可及性;
（3）安全性：不需进行输注前淋巴耗竭化疗，避免造成的相关毒性。

图 1 : 体外和体内CAR-T细胞治疗的比较。体外 CAR-T 需要经过体外制造，经过T细胞分离、重编程、扩增、收获冻存等体外制造步骤，并且在 CAR -T 细胞输注之前，需要进行淋巴耗竭化疗（LC），易于产生毒性。体外生产是“一患一制”，价格昂贵、流程繁琐，通用型体外 CAR-T安全性差。体内生产 CAR -T 细胞只需要注入纳米颗粒或携带病毒的CAR，这种CAR是“现货型的”、成本低廉、质量稳定的，与GMP更加兼容，可以大规模生产。

（二）体外 CAR-T 和体内 CAR-T 基因工程改造进展
体外 CAR-T 主要在体外使用递送系将CAR基因导入T细胞，在体外扩增工程化的 CAR-T 细胞，然后将 CAR-T 细胞重新输注给患者，输入体内的 CAR-T 细胞通过表面 scFv 片段靶向肿瘤细胞表面受体，由T细胞对肿瘤细胞进行精准杀伤。

体外 CAR-T 的核心作用原件为 CAR 结构，至今 CAR-T 细胞的 CAR 机构共进行了5代更新，第一代 CAR 结构由 scFv 和含有Fc受体γ链（FcγR）或单独CD3ζ链的细胞内信号结构域组成。第一代 CAR 的持久性较差，抗肿瘤疗效较低。为提高持久性，第二代 CAR 在一代的基础上，在 CD3ζ 之外，增加了一种共刺激分子，如 CD28 或 4-1BBL 或 OX40 等中的一种。第三代 CAR 是在 CD3ζ 的基础上，增加两种不同的刺激阈如 CD28 和 4-1BBL。第四代 CAR 也称为“重定向用于普遍细胞因子杀伤的T细胞”（TRUCKs），在第二代 CAR 的基础上，增加了T细胞活化核因子（如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18）。第五代 CAR 在第二代 CAR 的基础上增加了一段截短细胞质结构域，如来源于 IL-2 受体的β链（IL-2Rβ），旨在抑制免疫检查点减少CART细胞耗竭并增强抗肿瘤活性如下图2：

图 2 : 体外CAR-T 细胞CAR结构的五代演化。

体内 CAR-T 通过在体外制备产品化的递送系统。递送系统包括病毒递送系统（慢病毒和腺病毒递送载体）和非病毒递送系统（脂质纳米粒载体、聚合物纳米粒载体和外泌体），如图3。产品化的递送系统经过回输进入人体，通过细胞融合作用，将携带的 CAR 基因重组到T细胞基因组，借用T细胞的基因组的复制、转录和表达，实现T细胞在人体内的编辑，在原位产生 CAR-T 细胞，由CAR-T细胞实现对肿瘤的靶向杀伤作用，如图4。

图 3 ：体内 CAR-T 递送系统，慢病毒LV，腺病毒AAV，LNP 纳米微载体，Plymer聚合物纳米粒载体， Exosome外泌体。

图 4：体内 CAR-T 递送系统。LV含有一种或多种病毒糖蛋白（蓝色）和包装在核衣壳中的ssRNA基因组，根据糖蛋白的不同结合不同的细胞，通过细胞膜内吞作用将核酸转移到T细胞中，并整合到宿主基因组中。（B）AAV由二十面体蛋白衣壳中包裹着ssDNA基因组组成，细胞通过内吞作用摄取后，基因定向转移到细胞核中。（C）编码CAR的核酸与带正电荷的可生物降解聚合物（NC）或脂质（LNP）复合形成载体复合物。进入细胞后，mRNA有效载荷（1）可用于翻译。包装DNA 转座酶可能到达细胞核，整合到宿主染色质中。

不同的体内 CAR-T 递送方式均存在一定的优势和挑战，慢病毒和腺病毒递送方式在B淋巴细胞瘤清除上面显示出一定的治疗效果，但也存在免疫原性和插入性致癌的风险。脂质微球递送系统在心脏耗竭、抗白血病、实体瘤和血液瘤体的应用上显示一定的治疗前景，但也存在转染效率和严格的生产规范要求等问题，如下表所示：

（三）In vivo CAR-T 的体外制造技术
不同于体外 CAR-T 的制造和应用，需要经过从人体中分离出T细胞，使用工程化的手段如病毒转染、基因编辑等手段将核酸复合物定向到T细胞进行CAR装载，扩大培养T细胞实现细胞增殖，细胞收获、灌装、冻存，放行入库，细胞复苏，多次回输，长期随访。体内CART体外制造工序只需要在体外生产制备递送系统的如图5：

图 5：体外CAR-T和体内 CAR-T 制造和应用。

慢病毒递送系统制备系统常采用尼帕病毒（NiV）和麻疹病毒（MV）的胞膜蛋白，工程改造的关键是改造慢病毒的膜融合和T细胞靶向性，并将CAR基因包装到慢病毒。如对慢病毒天然的胞膜蛋白（如水疱性口炎病毒G蛋白，VSV-G）进行改造，使其更容易和T细胞进行膜融合，将原病毒糖蛋白替换为靶向T细胞的 scFvs的CD3/CD4/CD8配体。腺病毒是由24面体蛋白衣壳和单链DNA基因组，基因组包括rep和cap基因；rep编码复制和包装所必须的非结构蛋白，cap编码衣壳决定感染倾向，通过在AAV基因组中T细胞靶向部分，使其中保持转染性和T细胞靶向性。AV携带的转基因通常以圆形双链游离体的形式进入细胞核，不整合到基因组中，这意味着这些游离体将随着宿主的分裂而失去表达，如图6所示：

图 6：用于体内生成 CAR-T 细胞的慢病毒和腺病毒策略，需要通过突变附着糖蛋白来消除其天然嗜性，并通过引入T细胞特异性结构域来原位改造T细胞。

使用脂质微粒制备体内 CAR-T 递送体统，包括阳离子聚合物的纳米颗粒，脂质体的纳米微粒，以及基于肽类的脂质体，阳离子聚合物通过静电相互作用与带负电荷的核酸紧密结合，并凝聚成纳米复合物，避免被免疫系统消灭；脂质体纳米颗粒是由磷脂双层组成的人工囊泡，利用超声水合将DNA包裹进人工囊泡，如图7所示。基于肽的脂质体是一种通过自组装形成的非空泡纳米结构颗粒，是核酸治疗领域最先进、临床上最成功的非病毒递送平台之一，在mRNA疫苗和基因治疗中具有特别有前景的应用，包括tLPPs靶向脂质体，SORT脂质,包装过程如图8所示。

图 7：体内 CAR 疗法的阳离子聚合物和基于脂质体LNP的示意图。（A）阳离子聚合物纳米递送载体需要四个基本成分，包括阳离子聚合物、靶向配体、辅助元件和递送的CAR基因载体。（B）共挤法生产脂质体纳米载体。制备的脂质体化纳米转运蛋白可诱导注射后胰腺癌症TME原位生成CAR-MΦ，并可介导肿瘤杀伤。

图 8：靶向 LNPs 和 SORT LNPs 介导体内 CAR 细胞疗法的示意图。将 CAR 基因载体包裹在 tLNPs 中的过程，靶向T细胞，然后在体内对循环T淋巴细胞进行重编程，在原位生成 CAR-T细胞，在 TME 中原位产生CAR-MΦ。

（四）In-vivo CAR-T 的前景
最近，体内 CAR T 细胞疗法因其简单的制造工艺、可控的批次间差异和“现货型”的特点而引起了人们的持续兴趣。更重要的是，体内 CAR-T 细胞可以大规模生产，这可能会降低成本并扩大临床应用。目前，FDA批准的体外 CAR-T 产品均只在血液瘤方面展现临床效果，并存在 CAR 随机整合导致的致瘤，免疫抑制以及细胞因子风暴的风险。体内 CAR-T 能够很好低规避体外 CAR-T 的弊端，体内 CAR-T 靶向肿瘤微环境不仅产生 CAR-T 还产生 CAR-NK 和 CAR-M 细胞，对实体瘤体展现出一定的清除作用。无须回输细胞，不需要清淋处理，避免对免疫系统的损害。无需异体细胞回输避免宿主免疫抑制，展现出生物制造和临床应用的优势。作为一种有前景的免疫疗法，体内 CAR-T 细胞治疗受到各种限制的阻碍，包括病毒载体递送效率、免疫反应、耐久性和实体瘤适应性。然而，随着基因编辑技术、靶向递送系统和 CAR 结构设计的不断优化，这些问题有望得到解决。体内 CAR-T 疗法正逐步从实验室走向临床。在血液肿瘤中，体内 CAR-T 细胞治疗已显示出巨大的临床潜力。此外，这种新型疗法在治疗实体瘤方面取得了突破。与免疫检查点抑制剂（如PD-1抗体）或细胞因子（如IL-12工程外泌体）的组合策略可以进一步将应用范围扩展到其他适应症。临床前研究和早期临床试验表明，体内 CAR-T 细胞疗法是安全有效的。随着创新递送技术、扩大适应症和优化安全性的显著进步，体内 CAR-T 细胞治疗有望成为未来肿瘤免疫治疗的关键策略，为癌症患者带来更有效、更安全的治疗选择。体内 CAR-T 可能是未来的细胞治疗研究方向。