在生命科学和医学研究领域，精确地检测细胞凋亡是理解发育、疾病机制及药物疗效的关键。其中，TUNEL检测法因其高度的灵敏性和特异性，成为实验室中鉴定凋亡细胞的“金标准”之一。本文将全面解析TUNEL试剂盒，助您更好地将其应用于研究中。

它是一种基于生物化学反应的原位检测技术，用于在细胞或组织切片中，特异性标记因细胞凋亡而产生的DNA断裂片段。

• “剪刀”：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶会被激活，特异性地在DNA链的核小体间进行切割，产生大量带有3'-OH末端（即“缺口”）的DNA片段。
• “胶水”和“荧光标签”：TUNEL试剂盒中的核心酶——末端脱氧核苷酸转移酶，就像一个高效的“胶水”。它能将标记有荧光素（如FITC）、生物素或地高辛的dUTP（一种核苷酸），一个接一个地“粘”到这些DNA断裂末端的3'-OH上。
• “显影”：通过荧光显微镜观察，所有被成功“粘”上荧光标签的细胞（即发生DNA断裂的凋亡细胞）就会发出明亮的荧光，从而被清晰地识别和计数。

关键点：虽然TUNEL法主要针对凋亡细胞，但在晚期凋亡和坏死细胞中，由于DNA也被严重破坏，也可能呈阳性。因此，通常需要与其他方法（如形态学观察）结合进行确认。

• 核心功能：在细胞爬片、组织切片或流式细胞术样本中，准确区分并计数凋亡细胞与正常细胞。
• 提供数据：可以计算出凋亡细胞百分比，进行统计学分析，比较不同实验组间的凋亡水平差异。

• 神经退行性疾病：在阿尔茨海默病、帕金森病等模型中，检测神经元细胞的凋亡情况。
• 心血管疾病：研究心肌梗死、心力衰竭过程中心肌细胞的凋亡。
• 自身免疫病与病毒感染：评估免疫细胞的凋亡对免疫平衡的影响。
• 肿瘤生物学：检测肿瘤组织内部的自发凋亡区域，或评估放疗、化疗对肿瘤细胞的杀伤效果。

• 药效评估：在抗肿瘤药物筛选中，通过TUNEL检测可以直观地看到药物诱导肿瘤细胞凋亡的效果。
• 安全性评价：在新药研发中，检测药物是否对正常器官（如肝、肾）具有细胞毒性，诱导其发生异常凋亡。

• 体外：在细胞爬片上检测，比较各药物处理组的凋亡率。
• 体内：取小鼠肿瘤组织制作石蜡或冰冻切片，进行TUNEL染色。结果可显示药物主要诱导了肿瘤核心区还是边缘区的细胞凋亡，为药物作用机制提供线索。

1. 样本准备：细胞爬片、石蜡切片或冰冻切片。
2. 预处理：石蜡切片需脱蜡、水化。所有样本通常需要用蛋白酶K等进行通透，让酶和底物能进入细胞核。
3. TUNEL反应：在样本上滴加含有TdT酶和标记dUTP的反应液，于湿盒中避光孵育。
4. 洗涤与检测：
   • 荧光法：直接封片后在荧光显微镜下观察（如FITC标记，激发波长488nm，发射波长530nm）。
   • DAB显色法：若标记为辣根过氧化物酶，则需与DAB底物反应产生棕色沉淀，可在普通光学显微镜下观察。
5. 复染与封片：常用DAPI（蓝色荧光）复染细胞核，或苏木素复染，以显示所有细胞。
6. 图像采集与分析：使用荧光显微镜或共聚焦显微镜采集图像，并用ImageJ等软件进行定量分析。

• 设立对照：必须设立阳性对照（用DNA酶处理样本，诱导DNA断裂）和阴性对照（不加TdT酶），以确保实验结果的可靠性。
• 避免假阳性：坏死细胞、机械损伤或固定不当导致的DNA断裂也可能呈阳性，需通过细胞形态学（核固缩、碎裂）加以甄别。
• 优化条件：蛋白酶K的浓度和处理时间、TdT酶的反应时间都需要预实验进行优化。

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