离体心脏NADH荧光标测技术探究缺血再灌注对心肌及电生理特性的影响
2026-03-05 来源:本站 点击次数:35心肌能量代谢状态是反映心脏生理与病理变化的核心指标，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作为心肌能量代谢的关键物质，其含量变化可直接表征心肌细胞的能量代谢水平。NADH在紫外光下具有自发荧光特性，为无创、实时监测心肌能量代谢提供了天然标记物，也成为离体心脏功能研究的重要观测靶点。
基于此，本研究将可稳定维持离体心脏生理活性的Langendorff离体心脏灌流技术，与能够精准捕捉荧光信号的高分辨荧光标测技术相结合，构建了离体心脏NADH荧光标测技术。该技术无需对NADH进行外源性染料负载，可同步检测心肌电生理指标，实验条件可控性强，能够实时、精准地捕捉NADH荧光信号的动态变化，有效排除体内复杂生理因素的干扰，为离体心脏的多模态功能检测提供了稳定可靠的技术平台。
NADH 与动作电位的同步光学标测，突破了传统心脏电生理研究只能单一检测电活动、无法同步解析能量代谢与电兴奋交互调控的技术瓶颈，实现代谢‑兴奋耦联同视野、高时空分辨率动态捕捉，可阐明心肌生理病理状态下代谢变化与电生理重构的因果时序，精准识别药物心脏靶向效应与脱靶风险，弥补传统心脏安全性筛查不足，为心肌保护、心律失常机制研究与药物研发提供创新视角与标准化技术工具。
实验目的：
利用Langendorff灌流维持大鼠离体心脏的正常生理活动；利用高分辨荧光标测技术同步检测心肌缺血再灌注过程中NADH荧光幅值及心肌电生理相关指标的动态变化，探究缺血再灌注对心肌能量代谢及电生理特性的影响。
实验动物：
SD大鼠
实验方法：
实验原理：
1. Langendorff离体心脏灌流技术原理：离体动物心脏在恒温恒压条件下，将心脏套管插入主动脉，逆行灌流含氧的灌注液，由冠状动脉灌流心肌，灌流液经冠状静脉窦从右心房、右心室、肺动脉端流出，以维持离体心脏在外界正常的生理活动。
2. 高分辨荧光标测技术原理：在可兴奋样本上负载荧光染料，通过高速相机记录荧光变化来反应样本中各种离子浓度的变化，也可同步记录动作电位与钙信号等指标的改变。
Protocol（大鼠心脏NADH与动作电位同步标测）
一、实验前准备
（一）主要试剂
KH灌流液、Blebbistatin、RH237、肝素钠、异氟烷
（二）主要器材
手术剪、眼科剪、眼科弯镊、止血钳、手术缝线、注射器、主动脉插管、主动脉夹、培养皿
（三）主要溶液配方
1. KH solution（灌流液）
注：KCl、KH2PO4、MgCl2可配制为10×母液；溶液配好后需经0.22μm微孔滤膜过滤；使用前，提前30min充氧（95% O2， 5% CO2）饱和。
2. 兴奋-收缩解耦联剂Blebbistatin母液，DMSO溶解1mg/mL，分装为100µL/tube， -20℃储存备用。（摩尔质量292g/mol）
3. 电压敏感染料RH237，DMSO溶解为1mg/mL，分装为100µL/tube。
注：NADH在紫外光下（365nm）自发荧光，无需进行荧光染料负载；为避免反复冻融，将染料提前配制并进行分装储存于-20 ℃。
4. 肝素钠(1000U/mL)：用生理盐水稀释为所需浓度。
二、大鼠心脏获取与处理
1. 对SD大鼠进行称重后，腹腔注射肝素钠（3125U/kg），待15~20min后采用异氟烷麻醉，随后脱颈处死。
2. 将处死的大鼠固定于实验台，对腹部区域喷洒酒精消毒；剪开胸部皮肤暴露剑突，用镊子夹起剑突并沿左、右肋中部剪开胸腔，充分暴露心脏。夹起肺叶提起心脏，沿肺后部快速剪取心脏，立即置于预充氧（95％O2，5％CO2）的KH灌流液中。
3. 剥离心脏表面多余组织，清晰暴露主动脉；在镊子辅助下将主动脉快速套入灌流针，用主动脉夹固定后，以4-0手术缝线结扎主动脉与灌流针连接处（注：排除气泡）；采用KH灌流液对心脏进行逆行灌流，调节灌流速率至10mL/min，维持灌注压在60~70mmHg，持续灌流15~20min，排出心脏内残余血液，使心脏恢复并维持正常节律。
4. 待心脏灌流状态稳定、无残血流出后，将灌流体系切换为2号罐中预充氧的100mL KH灌流液，进行循环灌流。
三、心脏停跳及荧光染色（全过程均在避光环境下进行）
1. 心脏停跳：从灌流体系给药口注入300μL Blebbistatin至100mL循环KH灌流液中，通过高浓度药物作用减少心肌运动伪迹，观察至心肌收缩完全停止，全程约1~2min。
2. 荧光染料负载：向100mL 循环灌流体系中加入100μL 电压敏感染料RH237，持续循环灌流15min，使染料充分负载于心肌组织。
3. 实验设备调试：按顺序开启高速相机、LED激发光源（520nm光源用于激发电压敏感染料RH237，365nm光源用于激发 NADH自发荧光）、电刺激器、主机及电脑终端，随后启动OS、OR荧光信号分析与记录软件，完成设备预热与参数初始化。
高分辨荧光标测技术原理示意图
四、数据采集与记录
1. 将完成染料负载的离体心脏转移至恒温灌流浴槽中，保持灌流条件稳定。
2. 心电信号采集：将ECG电极分别置于心脏两侧，红极（+）贴附左室壁，白极（-）贴附右心房，连接电极并调试设备，确保ECG信号采集稳定。
3. 成像系统聚焦：将激发光精准聚焦于心脏成像区域，调整双摄像机与心脏的相对距离，调试至设备最大分辨率，确定并框选目标成像区域，保证荧光信号采集清晰。
4. NADH荧光信号采集：以NADH荧光幅值变化作为核心检测信号，对大鼠离体心脏实施左前降支结扎操作，动态采集并记录结扎前、结扎过程中及复灌后不同时间点的NADH荧光幅值变化。
5. 多指标同步检测与对比：分别采集大鼠离体心脏左前降支结扎前、结扎不同时间点及复灌后，缺血区域的NADH荧光信号、传导时间、动作电位时程等多项指标，完成各时间点指标的同步记录与对比分析。
A. 心脏结扎前、结扎5min、复灌5min时NADH荧光、传导时间、动作电位时程代表图
B. 心脏结扎前、结扎5min、复灌5min时ECG Ⅱ 导联代表图
C. 心脏结扎前、结扎5min、复灌5min时缺血区域动作电位波形代表图
D. 心脏缺血再复灌期间缺血区域NADH荧光动态变化统计图
E. 心脏缺血再复灌期间缺血区域心率变化统计图
F. 心脏缺血再复灌期间缺血区域动作电位激活时间动态变化统计图
G. 心脏缺血再复灌期间缺血区域动作电位传导速度动态变化统计图
H. 心脏缺血再复灌期间缺血区域动作电位除极时间动态变化统计图
I. 心脏缺血再复灌期间缺血区域动作电位时程动态变化统计图
J. 心脏缺血再复灌期间缺血区域动作电位时程离散度变化统计图
参考文献：
[1]A. S G ,Zexu L ,R. I E .Simultaneous triple-parametric optical mapping of transmembrane potential, intracellular calcium and NADH for cardiac physiology assessment[J].CommunicationsBiology,2022,5(1):319-319.DOI:10.1038/S42003-022-03279-Y.