【Cell】揭秘如何精准开发激酶激活剂，为心脏疾病带来新曙光

研究背景：
在药物研发领域，激酶抑制剂早已是癌症治疗的核心手段。然而，在心血管疾病、代谢性疾病的治疗中，往往需要增强特定的保护性信号通路（如PAK1、AMPK）， 但科学家们却长期面临一个困境：如何开发激酶激活剂？

近日，由牛津大学雷鸣教授团队主导，联合来自中国及欧洲多国的研究团队共同在顶级期刊《Cell》上发表了一项突破性研究，首次报道了一种小分子PAK1变构激活剂。文章不仅揭示了PAK1的“自身抑制释放”机制，还在肥厚型心肌病模型中证实了显著的治疗效果。更重要的是，提出了一种可推广的肽引导激酶激活剂发现策略。

为何激活比抑制更难？

1. 激酶激活剂：一个未被满足的临床需求
在人体内，激酶是信号通路的“开关”。抑制剂通过“关掉”异常活跃的激酶来治疗癌症，但很多疾病（如心力衰竭、糖尿病）恰恰需要“打开”特定的保护性激酶。然而，开发激酶激活剂远比抑制剂困难—因为它需要精准地理解激酶自身的“制动”机制。

2. PAK1：心脏保护的“守门员”
PAK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在心脏中扮演着至关重要的保护角色。以往研究表明，增强PAK1活性可以对抗病理性心肌肥厚、心力衰竭和心律失常。然而，此前从未有过直接、选择性的小分子PAK1激活剂问世。

3. 研究的突破口：自身抑制结构域
PAK1在静息状态下处于“自身抑制”状态——它的一个激酶抑制片段（类似于“安全插销”）会插入自身活性口袋，堵住底物和ATP的结合位点。研究团队设想：如果能找到一种分子把这个“插销”拔出来，就能激活PAK1。

研究方法：如何找到那把“钥匙”？

1. 肽引导的“锁”定位
团队首先从PAK1自身的“激酶抑制片段”中衍生出一个活性肽（PAP）。
原理：PAP就像一把“假插销”，能竞争性地结合到抑制片段所在的界面，把原来的“真插销”挤出去，从而激活PAK1。
作用：利用PAP作为分子探针，通过表面等离子体共振（SPR）和AlphaFold2结构预测，团队成功定位了一个此前未被报道的“自身抑制释放位点”（位于自身抑制结构域与激酶结构域之间），并将其命名为DEK motif。

2. 虚拟筛选与高通量实验
以DEK motif为靶点，团队对约200万个小分子进行了虚拟筛选，结合RapidFire-MS高通量酶活筛选，初步获得JB79等激活剂（图1F）。通过结构-活性关系（SAR）优化，得到活性更强的JB120。

3. 精准“画像”：光亲和标记-质谱（PAL-MS）
为进一步精确定位结合位点，团队合成了带有光交联基团的JB120-PAL探针。通过光亲和标记-质谱技术，他们鉴定出与激活剂直接结合的关键氨基酸残基（如图2E所示），最终将结合口袋精确定位在DEK motif区域。

4. 从“老药”中挖掘新用途
基于PAL-MS精确定位的口袋，团队再次进行虚拟筛选，从FDA批准药物库中意外发现PAK1-A1（艾曲波帕）和PAK1-A2，两者均能高效激活PAK1（图3B）。

5. 多维度机制验证
团队综合运用了天然质谱（native MS）、FRET生物传感器、氢氘交换质谱（HDX-MS）和分子动力学模拟，从不同角度证实了激活剂结合后，激酶抑制片段被“推开”，活性口袋暴露，PAK1发生构象变化并启动自身磷酸化。

研究结果：从分子到动物的全方位验证

1. 分子层面：揭示“钢琴键-锁”模型
团队首先验证了PAP的激活效果。通过SPR实验，他们证实PAP能够直接结合全长PAK1。AlphaFold2预测显示，PAP结合在自身抑制结构域与激酶结构域的界面，将内源的激酶抑制片段“挤开”。基于这一发现，团队对该界面进行虚拟筛选，获得首个PAK1激活剂JB79。

图1 生物活性肽引导的自身抑制释放位点鉴定

为了明确激活剂的结合位置，团队设计并合成了光亲和探针JB120-PAL。通过PAL-MS分析，他们成功鉴定出多个与激活剂直接相互作用的氨基酸残基，包括Tyr131、Glu315、Val385等，这些残基恰好位于自身抑制结构域与激酶结构域的界面，进一步验证了DEK motif是激活剂发挥作用的“靶心”。

图2 PAL-MS鉴定PAK1激活剂JB120结合所依赖的自身抑制释放位点中的关键残基

在锁定靶点后，团队从FDA批准药物中筛选出PAK1-A1和PAK1-A2，两者均能剂量依赖性地激活PAK1。天然质谱实验显示，PAK1-A1能够直接结合PAK1蛋白。

图3 靶向自身抑制释放位点以发现变构PAK1激活剂

更重要的是，FRET生物传感器实验直观地展示了激活剂与抑制剂诱导的相反构象变化：PAK1-A1处理使PAK1发生大幅构象重排，而抑制剂NVS-PAK1-1则使PAK1维持在“开放”的非活性状态。通过定点突变实验，团队验证了关键残基（如Lys141、Val318、Val385等）对PAK1-A1结合的重要性。

图4 激活剂与抑制剂诱导PAK1发生不同的构象变化

氢氘交换质谱（HDX-MS）结果显示，PAK1-A1结合后，激酶抑制片段区域的氘交换显著增加，表明该区域变得更为动态、不再被“卡住”。分子动力学模拟进一步揭示，PAK1-A1结合后，DFG基序维持在“开”的状态。综合这些数据，团队提出了“钢琴键-锁”模型：激活剂与抑制剂竞争结合于DFG基序相邻的亚口袋，一个“解锁”激酶，一个将其“锁死”。

图5 PAK1激活剂干扰自身抑制机制

2. 细胞层面：精准激活下游信号
为全面评估PAK1-A1的细胞效应，团队对H9C2心肌细胞进行了磷酸化蛋白质组学分析。结果显示，PAK1-A1处理显著改变了260多个磷酸化位点，其中MAPK信号通路（尤其是MKK7-JNK分支）被显著富集。

值得关注的是，PAK1自身（T229位点）磷酸化水平升高，而PAK2和PAK4的磷酸化未发生明显变化，表明PAK1-A1具有良好的亚型选择性。

通过免疫印迹实验，团队进一步确认PAK1-A1和PAK1-A2能够时间依赖性地增强PAK1自身磷酸化，并激活其下游底物Merlin，验证了磷酸化蛋白质组学的发现。

体外激酶活性实验表明，PAK1-A1能够选择性激活PAK1，而对PAK2、PAK3无明显激活作用，这一结果在独立的放射性激酶实验中得到进一步证实，确保了化合物的特异性。

图6 PAK1激活剂在细胞中刺激PAK1依赖性信号传导

3. 动物模型：逆转心肌肥厚，展现治疗潜力
在异丙肾上腺素（ISO）诱导的体外心肌细胞肥大模型中，PAK1-A1和PAK1-A2处理显著抑制了心肌细胞的增大，同时降低了肥大标志物ANP和BNP的表达水平。更重要的是，当化合物在肥大已建立后再给药时，仍然能够逆转已存在的细胞肥大，展现了治疗而非单纯预防的潜力。

在血管紧张素II（Ang II）诱导的小鼠心脏肥厚模型中，皮下输注PAP能有效减轻心脏质量增加和室壁增厚。

团队还在多种模型中验证了治疗效应：

心肌细胞特异性PAK1敲除小鼠（PAK1 cko）：PAP的心脏保护作用在PAK1敲除小鼠中消失，明确了效应的靶向性。

横主动脉缩窄（TAC）模型：JB79治疗同样改善了心脏功能、减轻了肥厚和纤维化。

E99K HCM小鼠模型（模拟人类肥厚型心肌病）：PAK1-A2口服治疗显著改善心功能、减轻室壁厚度，并抑制了内质网应激（ER stress）标志物的表达，揭示了潜在的分子机制。

图7 PAK1激活剂在细胞和小鼠心肌肥厚模型中显示出治疗效果

图S7 PAP、JB79和PAK1-A2在心肌肥厚模型中的治疗效果评估

4. 策略普适性验证：从PAK1到PKA
为验证该策略是否适用于其他激酶，团队将其应用于蛋白激酶A（PKA）。他们从PKA的抑制性亚基RⅠα中设计出激活肽，通过虚拟筛选成功鉴定出PKA变构激活剂Cpd1和Cpd2。

FRET实验证实，这些化合物在细胞中能够有效激活PKA。这一结果证明，“肽引导的自身抑制释放位点筛选策略”具有可推广性。

图S6 激活剂诱导的下游PAK1信号传导及靶向类似自身抑制释放位点的PKA激活剂的概念验证鉴定，与图6相关

一个策略，一条新路

1. 首次实现PAK1直接、选择性小分子激活
该研究成功开发了首个直接靶向PAK1的小分子变构激活剂，填补了该领域的重要空白。

2. 提出可推广的激酶激活剂发现策略
通过“肽引导→定位自身抑制释放位点→虚拟筛选→结构优化”的理性设计流程，为其他激酶激活剂的研发提供了全新范式。

3. 验证激酶激活剂在心血管疾病中的治疗潜力
在多种心肌肥厚模型中，PAK1激活剂展现出预防与治疗双重效果，为临床上缺乏有效治疗手段的肥厚型心肌病（HCM）提供了新的药物候选。

4. 深化对激酶调控机制的理解
提出的“钢琴键-锁”模型，揭示了同一调控界面如何通过细微差异实现“激活”与“抑制”的切换，为未来设计更精准的变构调节剂提供了理论指导。

长期以来，激酶激活剂的研发被视为“硬骨头”。这项研究不仅啃下了这块骨头，更重要的是总结出了一套可复制的方法论。从PAK1到PKA，从肽探针到小分子，从分子机制到动物疗效，这项研究为“如何理性设计激酶激活剂”交出了一份近乎完美的答卷。

随着这一策略的推广，我们有理由期待，未来将有更多针对心力衰竭、神经退行性疾病、代谢性疾病等领域的激酶激活剂问世，为那些“需要被激活”的疾病带来新的治疗希望。