• 构建体设计与制备：选取全长TF L、未知功能结构域L2、DNA结合结构域L3三种蛋白变体，通过系统内置的AlphaFold结构预测工具设计L2、L3，将三种变体导入系统云软件优化密码子后，添加3C和TEV序列；利用可溶性标签筛选技术，构建24个含不同可溶性标签的eGene构建体及1个无标签对照构建体，所有构建体C端均整合Strep标签和检测标签，分别用于磁珠纯化和蛋白定量。
• 无细胞混合体系配置：选取8种无细胞混合体系，在核心翻译机制基础上，添加金属辅因子、分子伴侣、二硫键促进剂及3C蛋白酶；结合TF L含两个LIM结构域的特点，在体系中加入Zn²⁺，稳定蛋白锌结合区域，为蛋白正确折叠提供适配环境。
• 自动化筛选与分析：将24个eGene构建体、8种无细胞混合体系及纯化磁珠、对照样品、缓冲液等加载至微流控卡盒，系统自动生成并分析192组表达图谱，24小时内筛选出每种蛋白变体对应的10组高表达组合并完成纯化，确定各变体的放大生产预测得率，为后续放大制备提供数据支撑。

• 筛选数据揭示优化方向：系统筛选的30组高得率表达条件中，所有构建体均含可溶性标签，全长TF L和L2适配P17标签，L3适配CUSF标签，与无标签构建体相比，蛋白表达量有所提升，体现了可溶性标签在蛋白可溶性功能筛选中的作用；无细胞混合体系中，Zn²⁺可稳定蛋白结构，GSSG、PDI⁺/GSSG的氧化环境配置，可提升不同蛋白变体的表达量，为复杂蛋白无细胞表达条件优化提供参考。

图1：TF L变体的AlphaFold结构预测。图示为全长TF L的预测结构（重点关注区域已高亮标注）。蛋白变体L2和L3基于上述区域筛选设计，同时获得了这些截短蛋白的结构预测结果。

图2：eGene构建体与无细胞混合体系的筛选。(A) 含可溶性标签的TF L eGene构建体设计方案。(B) 用于提高可溶性蛋白得率的无细胞混合体系筛选结果。

• 放大制备获得高纯度蛋白：选取适配表达组合进行过夜放大培养，在1.5mL体系中成功获得微克级三种TF L变体蛋白；SDS-PAGE分析显示，纯化后蛋白出现与预期分子量一致的单一条带，Western blot实验验证了蛋白标签的完整性，证实蛋白成功表达与纯化，可满足后续功能实验需求。
• 功能验证证实蛋白活性：通过DNA结合电泳迁移率变动分析验证蛋白生物学功能，结果显示，全长TF L可与含结合位点的标记DNA发生浓度依赖性结合，L3结构域可与DNA探针形成特异性复合物，阴性对照无结合现象；L2结构域未表现出DNA结合能力，为其功能研究提供了新线索，也证实eProtein Discovery系统制备的蛋白保留天然生物学功能。

三、无细胞蛋白表达技术的应用价值
结合本次TF L的制备与验证实验，eProtein Discovery系统凭借无细胞蛋白合成的独特技术特点，成功解决了TF L这类高度无序转录因子的制备难题，48小时内即可完成从DNA到功能性蛋白的全流程制备，有效突破了传统表达体系在复杂蛋白制备中的技术限制，为难表达蛋白研究提供了全新的技术路径。

除了转录因子制备，该系统还整合数字微流控、无细胞蛋白表达、荧光蛋白定量检测等技术，实现表达条件的高通量筛选与准确优化，可完成可溶性蛋白快速制备，其筛选结果可与体内表达体系衔接，可进行规模化制备。

在AI蛋白工程、de novo蛋白设计等前沿科研领域，eProtein Discovery系统可发挥难表达蛋白快速获取的优势，为人工设计蛋白、新型功能蛋白的制备与验证提供支撑，助力科研人员开展蛋白结构研究、靶向药物研发、再生医学等探索，推动无细胞蛋白表达技术在更多科研场景落地。上海曼博生物作为正式的nuclera中国代理，为国内科研人员、生物医药企业提供eProtein Discovery系统的产品咨询、采购安装、技术支持等全流程服务，如您需要欢迎点击咨询!（ https://www.mine-bio.com/nuclera/?utm_source=bio-equip&utm_medium=referral&utm_campaign=nuclera_article ）

本文基于eProtein Discovery无细胞系统公开资料由其中国提供商上海曼博生物整理，仅用于科研信息分享。上海曼博生物可提供eProtein Discovery蛋白表达系统、无细胞蛋白表达筛选系统、难表达蛋白快速制备及相关技术支持。