移码突变导致超过20%的孟德尔遗传病，传统基因替代疗法受到病毒载量与表达调控限制。CRISPR-Cas9诱导的NHEJ虽是主流修复机制，但传统观点认为其修复结果随机，难以预测。2026 年3月23日,北京脑科学与类脑研究中心(CIBR)熊巍团队在Nature Biomedical Engineering(IF26.6)期刊发表题为“Template-independent genome editing and restoration for correcting frameshift disorders”的研究论文。研究开发了一种无需模板的基因组编辑修复平台（Template-Independent Genome Editing for Restoration，TIGER），该平台具有可预测性、精准性和治疗潜力，为遗传性移码突变疾病提供了一种前景广阔的治疗策略。

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实验动物：WT小鼠

病毒产品：AAV9-CAG-mCherry

病毒滴度：1×10^13GC/ml

病毒用量：400nl

注射部位：耳蜗蜗管

AAV9-CAG-mCherry对小鼠内毛细胞实现100%转导

研究结果

1、TIGER关键因子的鉴定与跨模型预测可靠性评估

研究人员通过Pcdh15-av3j小鼠耳蜗模型（c.4522insA突变）筛选了4 种gRNA，发现读码框内编辑比例（in-frame ratio）是决定TIGER疗效的关键因素，大于30%的in-frame比例即可恢复超过50%的毛细胞功能，可作为评估TIGER效能的关键阈值。此外，长度恢复比例（length-restoring ratio），即恢复原始蛋白长度的编辑在所有读码框内编辑中的占比同样影响最终疗效。因此，筛选gRNA时需同时关注in-frame比例和length-restoring比例，二者共同决定TIGER的效力与疗效。进一步探索表明，可以利用野生型基因组序列来预测相应移码突变的in-frame比例和length-restoring比例，从而评估突变-gRNA的TIGER性能。为了评估TIGER因子在不同模型中的可预测性，研究者分析了10个耳聋相关基因的40个致病移码突变，共测试了118个gRNA（87个针对缺失突变，31个针对插入突变）；比较了小鼠耳蜗组织、N2a 细胞系以及多个预测算法（inDelphi、FORECasT、Lindel）的InDel谱。结果显示TIGER因子的预测准确性依次为组织样本 、细胞系、现有算法，强调了组织来源的数据是预测体内TIGER疗效的最可靠依据。

TIGER因子的同源序列可预测性

2、TIGER预测平台建立

由于切割位点与InsA插入位点之间至少相隔4个核苷酸，即便效果最优的长度恢复型 Pcdh15-av3j蛋白，也仍会携带至少一个氨基酸替换。研究者进一步分析了 118 个耳聋相关gRNA组合中，那些能够恢复蛋白长度的编辑产物在核苷酸水平的序列变化，以评估其能否产生完全野生型的蛋白。缺失突变中，当切割位点位于突变上游-1位时，产生的氨基酸改变最少；插入突变中，切割位点位于突变上游-1位或下游+1位时，产生的氨基酸改变最少。在所有恢复长度的编辑产物中，10.3%的缺失突变和12.9%的插入突变能够产生完全野生型蛋白。通过重新训练inDelphi算法，研究团队整合了HEK293T和耳蜗组织数据，显著提升了插入/缺失编辑模式的预测精度。基于此，开发了TIGER在线预测平台（https://tigerportal.cibr.ac.cn/），可对单碱基移码突变提供gRNA推荐，并输出读码框内比例、长度恢复比例、野生型蛋白比例等关键指标。

TIGER编辑产物的核苷酸水平预测

3、TIGER体内治疗OTOF移码突变耳聋的效果评估

OTOF c.1236delC是TIGER评分极高的靶点，是体内治疗验证的理想候选。研究团队构建了Otof c.1233delC纯合突变小鼠模型（对应人类OTOF c.1236delC），该小鼠完全缺失 Otoferlin蛋白并表现为全频耳聋。通过双AAV9载体将SpCas9和Otof-1233delC-gRNA1注入新生小鼠（P0-3）内耳。结果显示，约44%的内毛细胞在注射后3个月仍表达Otoferlin，带状突触数量从突变鼠的6.5%恢复至11.0%，此外听力也得到有效恢复。这些结果证明了TIGER在体内对遗传性疾病的治疗功效。进一步的评估证实TIGER能够实现精准、持久、稳定的基因修复效果，在长期疗效和内源表达调控方面均优于传统的基因替代疗法。最后，研究团队将TIGER与引导编辑（PE）进行了直接比较，使用多种PE系统在Otof1233delC/1233delC 3T3细胞系中进行修复测试。结果显示，虽然最优的PE组合能够恢复野生型 OTOF 序列，但其编辑效率比TIGER-gRNA1低约30倍，表明在修复该移码突变时TIGER在编辑效率上显著优于引导编辑技术。

TIGER处理恢复模型小鼠的听力

研究结论
本研究鉴定了由NHEJ介导的DNA双链断裂修复在核苷酸水平上的关键规律，这些规律决定了移码突变的治疗性校正效果。研究团队将这些规律整合为一套预测算法，并通过在线门户网站（https://tigerportal.cibr.ac.cn/）提供使用，同时在耳聋小鼠模型中验证了该算法的体内有效性。研究结果凸显了TIGER平台在治疗应用中的可预测性、精准性与治疗潜力，为治疗遗传性移码突变疾病提供了极具前景的策略。