酵母双杂交技术是一种基于真核生物转录因子结构的分子生物学方法，主要用于研究蛋白质之间的相互作用，已成为发现和验证蛋白互作的经典工具。核心原理主要是利用转录因子（如GAL4）的分离型特性：其DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）在物理上分开时不具功能，但当分别与两个待测蛋白（诱饵蛋白X和猎物蛋白Y）融合后，若X与Y发生相互作用，BD和AD便被拉近，从而重建有活性的转录因子，激活报告基因（如LacZ、HIS3）的表达。

基本流程

1. 构建载体：将已知蛋白X的基因与BD融合（诱饵载体），将待测蛋白Y的基因与AD融合（猎物载体）。
2. 共转化酵母：将两种载体转入同一酵母细胞（通常为GAL4缺陷型）。
3. 筛选互作：涂布于缺乏相应营养的培养基（如缺少亮氨酸、色氨酸以维持质粒）并检测报告基因表达。若报告基因激活（如菌落生长、显色），则证明X与Y互作。

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文章标题：EjAP2-1, an AP2/ERF gene, is a novel regulator of fruit lignification induced by chilling injury, via interaction with EjMYB transcription factors.

发表期刊：Plant Biotechnology Journal (IF 13.8).

研究思路：木质素的生物合成受多种转录因子的调控，但AP2/ERF转录因子在木质素生物合成中的作用研究较少。作者从低温贮藏枇杷果实木质化过程中分离到18个EjAP2/ERF基因，其中EjAP2-1的表达与果实木质化呈负相关，可以调控木质素生物合成基因启动子的活性，但不与启动子(Ej4CL1)相互作用。作者利用酵母双杂交研究了EjAP2-1的作用机制，发现EjAP2-1与EjMYB1和EjMYB2之间存在蛋白-蛋白相互作用，EjAP2-1与EjMYB1或EjMYB2结合可以抑制Ej4CL1启动子。

结果解读：

1. 作者将EjAP2-1与pGBKT7 (BD)融合，EjMYB1/2与pGADT7 (AD)融合，共转化酵母菌株。

2. 以BD-p53和AD-T为阳性对照，BD-Lam和AD-T为阴性对照，在不同的SD培养基中培养。

3. 在SD/-Leu-Trp的培养条件下，四类酵母菌都能生长，表明BD载体与AD载体已成功转化酵母菌并稳定表达。

4. 在SD/-Leu-Trp-His-Ade的培养条件下，阳性对照酵母菌（BD-p53+AD-T）可以生长，阴性对照酵母菌（BD-Lam+AD-T）不能生长，表明酵母内的双杂交系统能正常发挥功能。

5. BD- EjAP2-1+ AD- EjMYB1组酵母菌和BD- EjAP2-1+ AD- EjMYB2组酵母菌能正常生长，表明EjAP2-1与EjMYB1和EjMYB2之间存在蛋白-蛋白相互作用。