Section.01
应用一：
生物素化核酸相关

一、助力转录组测序

链霉亲和素在转录组测序中的扮演着非常重要的角色。最早是用磁珠结合生物素化 oligo (dT)，从而特异性捕获带 poly (A) 尾的 mRNA。随着研究深入，更前沿的表观转录组与 RNA 测序结合，推动转录组测序技术向模块化方向发展。

ONE-seq，是一种用于鉴定含有 NAD 加帽的 RNA 转录本的技术。它通过一步化学酶促反应对 NAD 加帽 RNA 进行生物素化修饰，使其与链霉亲和素结合，随后利用 Nudix 磷酸水解酶 NudC 催化的洗脱，从链霉亲和素磁珠 (HY-K0208) 上特异性地收集 NAD 加帽 RNA，用于高通量测序 (图 1) 。

实验小 Tips

1、生物素化的 RNA 和链霉亲和素磁珠孵育时，可以将 Biotin-RNA 溶解在  DEPC 水中，并加入 0.4 U/μL RNase 抑制剂在 25°C 下孵育 30 min。
2、将 Biotin-RNA 洗脱下来时，可以将将磁珠与 10 mM 生物素溶液在 94°C 孵育 8 min，洗脱生物素标记的 RNA。

二、研究 RNA-蛋白互作

RNA 结合蛋白 (RBPs) 是转录和转录后基因调控的关键参与者，在众多成熟方法中，蛋白质下拉实验 (PDs) 可能是最受认可和最常用的方法。

通过将生物素化 RNA 锚定在链霉亲和素包被的磁珠上，可以检测其相互作用蛋白，从而实现核糖核蛋白 (RNP，是由 RNA 和蛋白质组成的复合体) 的高效分离。这个方法的主要局限性在于生物素化探针的设计以及对其与靶蛋白结合能力的测试。

RNA-蛋白质互作实验的常规流程如图 2。

因为 RNA 与 RBP 的相互作用可以是稳定的、易于实验验证的，也可以是高度动态的、瞬时的、更难以表征的。所以实验的缓冲液体系有优化的空间。

• 如果需要检测下拉产物中核酸组分，可选择 95% Formamide, 10 mM EDTA 作为洗脱液主要组分，95°C 煮样后，用含有 7 M 尿素的 8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定^[3]。
• 如果是检测下拉产物中蛋白质，可以直接使用含有 50 mM DTT 的 1× SDS-PAGE 上样缓冲液，煮沸后上样^[3]。也有文献使用 20 mM PBS (pH 7.5) 、1 M NaCl、0.5 mM EDTA、0.1% Triton X-100、1 mM DTT 洗脱磁珠上的蛋白后进行质谱检测^[2]。

Section.02
应用二：筛选生物素化
小分子的靶标蛋白

链霉亲和素-生物素体系也可以用于筛选生物素化小分子的靶标蛋白。

例如，将生物素标记的肌醇与链霉亲和素磁珠孵育，然后再加入蛋白质提取物孵育，通过磁性分离得到与肌醇特异性结合的蛋白。在该实验中可以使用未标记的肌醇消除生物素标记的肌醇与其靶蛋白的结合，通过该步骤反向验证肌醇与其靶蛋白存在结合 (图 4) 。
图 4.游离肌醇可消除生物素标记的肌醇与其靶蛋白的结合^[4]。
(A) 将 PC3 细胞的细胞裂解液与 40 μM 生物素、40 μM 生物素标记的肌醇 (Biotin-Ins) 或 4 mM 未标记的肌醇 (Ins) 孵育；然后用链霉亲和素磁珠下拉肌醇相互作用蛋白，并使用特异性 AMPKα、AMPKβ 和 AMPKγ 抗体进行免疫印迹分析。(B) 将 200 ng GST-AMPKγ1 与 40 μM 生物素、40 μM 生物素标记的肌醇 (Biotin-Ins) 或 4 mM 未标记的肌醇 (Ins) 孵育 2 小时，然后用链霉亲和素磁珠进行下拉实验。通过 GST 抗体免疫印迹法检测相互作用。

使用磁珠进行样品预清除是必要的步骤 (step 3)，可以减少非特异性结合，并在相互作用复合物组装之前最大限度地减少非靶标分子的共纯化 (图 5) 。

当然，内源性生物素干扰是生物素下拉法筛选生物素化小分子的靶标蛋白的一个痛点。

偷偷告诉你！如果生物素化小分子是在细胞生长过程中加入，建议使用 Alkyne 基团标记的小分子，在样品预清除生物素步骤之后，再和 Biotin-azide 通过点击化学反应标记上生物素，再进行磁珠下拉实验，可以有效规避内源性生物素干扰。

不过，最新的研究表明，合成的链霉亲和素的对映体，能够特异性结合 L-生物素，而不识别内源性 D-生物素^[5]。该技术的推广还需要时间验证，让我们一起拭目以待吧~

Section.03
应用三：
富集细胞膜蛋白

在细胞膜蛋白研究中，可以利用链霉亲和素-生物素体系对细胞表面蛋白进行高度特异、温和且可富集的标记、分离和检测。实验时要先使用生物素化试剂，对细胞外结构域或者膜蛋白进行标记。

例如，在肠道菌与宿主肠道细胞互作机制的研究中。使用膜通透性差的生物素标记宿主细胞表面的膜蛋白。然后使用温和的细胞裂解液 (1% NP-40 等) ，裂解细胞，提取细胞膜蛋白；细菌的裂解则需要加入溶菌酶 (300 μg/mL) 和 1% (v/v) Triton X-100，并加入 DNase I (10 mg/mL) 和 MgCl₂ (10 mM) 以去除粘稠的核酸，以得到细菌表面的蛋白。进行下拉实验时先将细胞膜蛋白与磁珠孵育，再与细菌膜蛋白孵育^[6]。

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