实验概要
神经皮层类器官，可在体外模拟人类大脑皮层三维结构与神经网络发育，规避动物模型的物种差异性缺陷，是神经电生理研究的优质体外模型。钙离子作为神经元信号传导的关键信使，胞内钙动态变化直接反映神经元兴奋性与神经回路成熟程度。

本实验采用钙成像标测技术，经场刺激、离子霉素药物干预诱导钙信号变化，实时记录类器官钙活动特征，以此评估体外类器官神经功能发育水平，为神经发育机制研究与候选药物筛选提供实验支撑。

Protocol（神经皮层类器官检测方案）

一、实验前准备
（一）主要试剂：
神经皮层类器官完全培养基、HBSS溶液、Fluo-4 AM母液、Pluronic F127溶液、离子霉素粉末。

（二）主要溶液配方：
1. 荧光染料工作液：等体积混合培养基与 Fluo-4 AM母液，添加终浓度0.02%的 F127，现配现用、避光保存。
2. 12.5 μM离子霉素工作液：HBSS溶液稀释离子霉素配制。

二、实验步骤
1. 类器官预处理
将低温转运获得的神经皮层类器官转移至37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养3天，期间观察培养基状态及类器官形态。确认培养基无浑浊污染、类器官结构完好后，方可备用。

显微镜下观察：培养两天的神经皮层类器官

2. 探针负载染色（全过程避光操作）
将类器官从6 孔板转移至12 孔板，每孔加入500 μL培养基和500 μL Fluo-4 AM，并混入0.02% F127。37 ℃、5% CO₂条件下避光孵育40 min，孵育结束后，用HBSS洗涤2次以去除游离染料，再加入1 mL HBSS避光静置20 min，完成探针的胞内去酯化。

三、实验结果
1. 场刺激下记录钙信号变化
持续HBSS灌流，设置刺激参数（强度10 V、脉宽10 ms、频率2 Hz、刺激时长5 s），全程记录钙荧光信号变化，采集钙信号。

左图为荧光显微镜下皮层类器官染色全貌，右图为10x成像镜下高速相机拍到的静息视野


上图为场刺激后皮层类器官钙信号幅值变化情况

2. 离子霉素作用下检测钙信号变化
持续HBSS灌流，更换12.5 μM 离子霉素溶液灌流60 s，随后切换HBSS持续灌流，连续记录钙信号，保存荧光变化曲线与钙信号传导热图。

波形图为皮层类器官给予离子霉素后钙信号幅值变化情况；传导热图为给药后不同时间的钙信号幅值，分别对应：静息、峰值、再逐渐恢复静息三种状态

本实验由河南省医学科学院电生理研究所与斯高研究院联合共创，如您对相关技术感兴趣，欢迎前来河南省医学科学院电生理研究所参观交流 。