该研究由Alexandr Klioutchnikov、Damian J. Wallace、Caleb Berdahl、Adam Sugi、Juergen Sawinski 与Jason N. D. Kerr共同完成，论文题为Simultaneous two- and three-photon multiplane imaging across cortical layers in freely moving mice，于2026年6月在Nature Methods在线发表。

重要发现
01多模态多光纤耦合的头戴式成像系统架构
该研究搭建的多平面显微系统采用双光子与三光子混合激发方案，适配不同皮层深度的成像需求：960nm双光子激发适用于浅层皮层，1300nm三光子激发穿透能力更强，适用于深层皮层，二者最优成像深度交界约为皮层下450μm，配合可独立调节的能量分配，可实现跨层级的信号强度均一化。

系统通过时间复用技术实现多平面近同步成像：双光子光束经偏振分光结构分为四路独立通道，每路激发脉冲依次引入8ns时间延迟，分别耦合进四根空芯光纤；三光子光束单独由一根光纤传输。五根光纤尖端沿轴向设置不同相对位置，经光学系统聚焦后，在样本内形成五个轴向分离的焦平面，其中四个双光子平面相邻轴向间距为80μm，总轴向覆盖240μm，搭配独立的三光子深层平面，可完整覆盖小鼠皮层多个功能层级。

成像端采用微型机电扫描结构实现二维扫描，最大视场可达450×600μm，标准模式帧率为9.73Hz，另有高速模式支持小视场下的更快成像。荧光收集采用双通道硅光电倍增管检测方案，利用激发脉冲的时间差设置对应信号积分窗口，将单探测器信号拆分至五个成像平面，无需额外空间分光结构，有效控制头戴端体积与重量，整机仅2.5g。系统还集成两组电动调焦透镜，一组整体调节所有平面的成像深度，另一组单独调节双光子与三光子平面的相对位置，支持目标神经元群体的精准定位与长期追踪。

02通道串扰的迭代解混算法与成像性能验证
由于时间复用的脉冲间隔极短，加之探测器与传输线路的响应特性限制，前序通道的荧光信号会拖尾混入后续通道，形成单向通道串扰，影响成像对比度与信号准确性。针对该问题，研究团队开发了基于迭代优化的串扰解混算法：通过计算相邻通道间的像素级相关系数估算串扰比例，再逐通道扣除前序通道的串扰分量，实现串扰的有效抑制。

研究采用10μm荧光微球制备真值数据验证算法性能：先开启所有通道采集混合图像，再依次单独开启每个通道采集对应平面的真实图像作为基准。结果显示，经解混处理后，后序通道的前序污染信号平均降低至原有水平的1/4.4，串扰水平与真值数据无统计学差异。应用于在体神经元成像数据，可有效消除不同平面神经元信号的相互干扰，清晰分辨每个平面的独立神经元形态与钙活动信号。

研究从两个维度评估光损伤风险：一是对比成像时段首尾的神经元基线荧光强度，二是对比钙瞬变的衰减时间常数。统计结果显示，五个成像平面的神经元基线荧光在长时程连续成像前后均无显著变化，钙瞬变的衰减动力学也未出现明显改变，证明系统的激发能量设置不会造成明显神经元光损伤，可支持长时间在体成像实验。

针对多光纤线缆可能限制动物活动的问题，研究设计了配套的配重悬吊系统，抵消线缆大部分重量，仅保留极小负载作用于小鼠头部。行为学对比显示，佩戴该显微镜的小鼠，其平均运动速度、跑动时长占比、总运动路径长度等指标，与仅佩戴位置追踪标记的小鼠无统计学差异；对比单光纤与五光纤线缆的影响，也未发现动物运动行为的显著区别。对头部角加速度的定量分析显示，佩戴显微镜仅对头部转动加速度有微小影响，不会阻碍小鼠完成跳跃、缝隙穿越等复杂行为。

04皮层多层神经元的决策行为活动差异
研究人员利用该系统探究了自由活动小鼠在后顶叶皮层缝隙穿越决策任务中的层间神经元活动差异。实验中小鼠需自主判断两个高架平台的距离，完成跳跃穿越以获取食物奖励，系统同步记录皮层2/3层与第5层的神经元活动。

将神经元活动与穿越着陆的行为时刻对齐分析后发现，两层神经元的活动时序存在显著差异：皮层2/3层存在大量序列性激活的神经元，在穿越行为发生前、过程中以及发生后均有对应亚群依次激活，形成覆盖完整决策-执行过程的活动序列；而第5层的序列性激活神经元占比更低，活动高峰主要集中在穿越完成后的奖赏获取阶段。

与随机打乱的时序数据对比显示，两层神经元的行为相关序列活动均具备统计显著性：皮层2/3层在穿越前后5秒窗口内的序列神经元密度约为随机数据的2倍以上，第5层在穿越后5秒内的序列神经元密度约为随机数据的2.95倍。该结果直接证实了后顶叶皮层不同层级神经元在决策过程中的功能分化，验证了多平面成像技术在解析神经环路层间机制中的应用价值。

创新与亮点
该研究突破了现有头戴式多光子显微镜单次仅能记录单个皮层平面、深层与浅层成像难以兼顾的技术瓶颈，提出双光子与三光子融合的时间复用多光纤成像方案，实现五个平面的近同步并行采集，帧率不受成像平面数量限制，轴向成像范围可覆盖从浅层到深层的多个皮层层级。针对多通道时间复用带来的单向串扰问题，开发的迭代解混算法可在不损失信号的前提下有效抑制通道干扰，保障了多平面成像的信号质量。

该技术为自由行为动物的皮层多层神经环路研究提供了轻量化工具，可应用于决策、感知、运动控制等多种复杂行为范式，实现跨层级神经元活动的同步记录，为解析皮层信息处理的层间机制、构建更精准的脑功能模型提供技术支撑，也为微型化在体成像技术的临床转化提供了新的研发思路。

总结与展望
本研究研发的双/三光子融合头戴式多平面显微镜，可在自由活动小鼠中实现跨多个皮层层级的近同步神经元成像，具备长期稳定、生物相容性好的特点，并成功揭示了后顶叶皮层不同层神经元在决策行为中的功能时序差异。未来可进一步拓展成像平面数量、优化光纤集成度，结合光遗传刺激实现成像与调控的一体化，推动神经环路机制研究向更深层、更精细的方向发展。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Klioutchnikov A, Wallace DJ, Berdahl C, Sugi A, Sawinski J, Kerr JND. Simultaneous two- and three-photon multiplane imaging across cortical layers in freely moving mice. Nat Methods. 2026 Jun 9.

DOI:10.1038/s41592-026-03125-7.