牙髓干细胞（DPSCs）分泌血管生成因子，如 VEGF，以促进 EC 增殖和迁移，启动新血管形成，并逐步作为周细胞提供结构支持并稳定新生血管。然而，参与微调新生血管芽和血管稳定的各种促血管生成和抗血管生成的因素尚未完全理解。以往研究表明，与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的直接接触培养会推动 DPSC 向平滑肌细胞（SMCs）的分化，在此过程中，转化生长因子-β1（TGF-β1）的上调至关重要。有趣的是，属于 TGF-β 超家族的激活素A（Activin A）在 DPSC-HUVEC 共培养中也显著增加，并在第6天达到峰值。然而，其在 DPSC-HUVEC 共培养过程中调控血管生成的作用仍然难以确定。

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Activin A 是一种多功能细胞因子，参与多种生物过程，包括胚胎发育、细胞增殖与分化、免疫反应调节以及伤口愈合。Activin A 通过上调其血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）来抑制 HUVEC 增殖和血管生成，该受体是 VEGF 的诱饵受体，从而减少 VEGFR2 的活化及随后的 EC 血管形成。由于 DPSCs 与 HUVECs 的直接相互作用重现血管生成过程并诱导 Activin A 的分泌，有理由假设 Activin A 可能参与 DPSC-HUVEC 共培养中成熟且稳定的微血管网络形成。

基于此，香港大学牙医学院修复牙科学联合广州市口腔再生医学基础与应用研究重点实验室团队在一项研究中利用体外 DPSC-HUVEC 共培养模型，探讨了 Activin A 表达的动态模式及其在调控细胞功能中的作用。研究证明 DPSC-HUVEC 共培养显著促进 Activin A 的分泌，Activin A 未影响 DPSC 向 SMCs 的分化，但破坏 HUVECs 中 VEGF 受体的平衡，抑制 HUVEC 新生血管芽并增强血管稳定。这些发现揭示了在血管形成和稳定过程中，HUVECs 与 DPSCs、Activin A 和 VEGFR1/2 之间的关键旁分泌串扰，这可能成为加速牙髓血管形成和再生的分子靶点。研究成果发表于 The International Endodontic Journal 期刊题为“Activin a regulates vascular formation and stabilization in direct coculture of dental pulp stem cells and endothelial cells”。

首先，ELISA 表明，DPSCs 和 HUVECs 的直接共培养中 Activin A 分泌显著增加，而在 DPSCs 或 HUVECs 单培养中水平极低（图1 a）。与单培养相比，D+E 共培养中激活素结合蛋白——卵泡抑素（Follistatin）的分泌下调且基因表达降低，INHBA 基因表达上调（图1 b-d）。VEGF 的分泌模式与 Activin A 相反。在早期和晚期，D+E 共培养的 VEGF 浓度显著低于 DPSC 单一培养，甚至无法检测到（图1 e）。相比之下，D+E 共培养中的 VEGF 基因表达在共培养后第1天和第6天保持升高（图1 f）。为验证 DPSCs 与 HUVECs 直接共培养对 Activin A 分泌的必要性，将两者进行间接共培养，结果显示 DPSC 或 HUVEC 单培养与 D+E 间接共培养在 Activin A 分泌上无差异（图1 g）。这些数据表明，DPSCs 和 HUVECs 的直接接触共培养会诱导 Activin A 分泌。

为评估 D+E 共培养中 Activin A 的分泌是否介导 DPSC 向 SMCs 的分化，将其与 DPSCs 共处理6天。结果显示，DPSCs 用 Activin A（25、50和100 ng/mL）处理后，尽管 RNA 水平变化轻微或无显著变化，但未引起 SMC 特异性标志物（α-SMA、Calponin 1和SM22α）蛋白水平的显著变化，这说明 Activin A 不影响 DPSC 分化为 SMCs 的过程。

图1    Activin A在牙髓干细胞（DPSC）单培养、人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）单培养和DPSC+HUVEC共培养中的表达和分泌。

接下来，为探讨 Activin A 对血管生成反应的影响，HUVECs 在指定时间点用 Activin A（100 ng/mL）处理。CCK-8结果显示，与对照组相比，Activin A 显著减少了 HUVEC 增殖，相比之下，与 VEGF 联合处理显著消除了抑制作用（图2 a）。划痕实验评估 HUVECs 的迁移过程，发现 Activin A 对 HUVEC 迁移具有抑制作用，相比之下，VEGF 刺激显著增强了迁移率，而 Activin A 抑制了 VEGF 诱导的 HUVEC 迁移（图2 b）。Matrigel管形成分析显示，Activin A 抑制 HUVEC 管形成能力，与 VEGF 联合处理可以通过增强分支数和总管长来逆转 Activin A 的作用（图2 c）。在3D球体出芽试验中，Activin A 预处理的 HUVEC 球体较对照组发芽长度减少约18.9%。此外，VEGF 诱发的发芽也被 Activin A 共处理显著抑制（图2 d）。与功能实验检测一致，血管生成激活标志物 vWF 和 CD31 的 mRNA 和蛋白表达在 Activin A 处理后显著抑制（图2 e、f）。总体而言，Activin A 刺激降低了 HUVEC 血管生成能力，部分逆转了 VEGF 的促血管生成效应，表明其可能在 VEGF 介导的血管生成中起关键作用。

为了解 DPSCs 与 HUVEC 相互作用如何通过自分泌或旁分泌机制影响血管生成反应，随后分析了暴露于 DPSC 单培养或 D+E 共培养的 CM 中 HUVEC 功能反应。结果显示，培养3天后，D+E-CM 显著降低了 HUVEC 增殖，且划痕愈合速度显著慢于对照组。为探究 Activin A 是否与 D+E-CM 对 HUVEC 增殖和迁移的抑制作用有关，将 HUVEC 暴露于添加 Activin A 中和抗体（IgG）的 D+E-CM 中，发现细胞增殖和细胞迁移均增加，也增强了 HUVEC 管形成的能力，同时抵消了 HUVEC 暴露于 D+E-CM 导致的发芽长度显著减少这一效应。血管生成标志物的表达与这些功能结果一致，D+E-CM 对 vWF 和 CD31 表达的抑制作用在 Activin A 中和后被部分逆转。

图2     在用Activin A处理后，HUVECs的血管生成功能。

共培养中编码 VEGFR1 的 FLT-1（FMS样酪氨酸激酶1）基因的表达在第6天进行了评估（图3 a），发现在 D+E 共培养中，可溶性（s）和膜结合型（m）形式的 FLT-1 均显著增加，且主要在 HUVEC 中表达。与 qRT-PCR 结果一致，D+E 共培养中 VEGFR1 分泌迅速增加（图3 b）。

为探究 D+E-CM 是否介导 D+E 共培养中 FLT-1 的上调，在有或无 IgG 的预孵育下在 D-CM 或 D+E-CM 中培养 HUVEC 48 小时，发现暴露于 D-CM 会略微降低 sFLT-1 和 mFLT-1 表达（图3 c），D+E-CM 暴露使 FLT-1 分泌增加4.8倍（图3 d）。相比之下，中和抗体 IgG 部分消除了 D+E-CM 对 FLT-1 表达的刺激效应。

为进一步评估升高的 FLT-1 是否消耗了共培养过程中产生的大部分 VEGF，在与 DPSCs 共培养之前，用靶向 FLT‐1 （si‐FLT‐1）或 si‐NC 的 siRNA 转染 HUVECs，共培养6天后，ELISA 结果显示，与转染 si-FLT-1 的 HUVECs 共培养的 DPSCs 的 VEGF 浓度是对照组的1.56倍，这表明 HUVECs 中 FLT-1 的增加是共培养过程中 VEGF 耗竭的原因（图3 e）。
 

用 Activin A 刺激 HUVECs 在第3天显著上调了 FLT-1 表达。相比之下，编码 VEGFR2 mRNA 的 KDR 仅略有增加（图3 f）。Activin A 诱导了 HUVECs 中 VEGFR1/VEGFR2 mRNA 高比值。与 mRNA 表达一致，Activin A 在两个时间点均显著提升了 HUVECs 中 sFLT-1 分泌（图3 g），还提高了 VEGFR1 蛋白的表达（图3 h）。这些研究表明，Activin A 的抗血管生成效果部分源于其提升 VEGFR1/VGEFR2 表达比值的能力。

为进一步研究 Activin A 处理是否抑制 VEGF 诱导的 VEGFR2 激活，HUVECs 先用重组 Activin A 预处理48小时，随后用 25 ng/mL VEGF 刺激15分钟，发现 VEGF 处理显著增强 VEGFR2 的磷酸化，而 VEGF 诱导的 VEGFR2 磷酸化在 Activin A 预处理的 HUVEC 中降低（图3 i）。高浓度的 VEGFR1 主要通过与 VEGFR2 竞争性地结合在 VEGF 上作为 VEGF 诱饵，阻止 VEGF/VEGFR2 信号的激活。
 

图3      DPSC-HUVEC共培养和Activin A处理的HUVEC中VEGF受体的表达。

为确定导致 D+E-CM 中 Activin A 增加的细胞，收集共培养细胞并用 Dynabeads CD31 分离，将分离的 DPSCs 复制培养收集 CM，同时单培养的 DPSC 进行相应的复制。与 HUVECs 共培养的 DPSCs CM 中 Activin A 的分泌水平远高于 DPSCs 单培养。与 DPSC 单培养相比，INHBA 在分离 DPSCs 中的 RNA 表达也有所增强。此外，从 D+E 直接共培养分离的 DPSCs 中，Activin A 的蛋白表达高于 DPSC 单培养和 D+E 间接共培养中的 DPSCs。这些结果表明，在 DPSC-HUVEC 共培养中主要是 DPSCs 分泌 Activin A ，且细胞间直接接触培养对于触发 DPSCs 中的 Activin A 分泌至关重要。

最后，为了调查 Activin A 是否参与 DPSC-HUVEC 共培养中血管稳定，在血管网络形成后，将 sh-NC 转染的 DPSCs 或 INHBA 敲低的 DPSCs 播种到基质上。结果显示，NC-DPSC 播种后，原有管状网络的分支点合并形成更大更厚的管状结构，NC-DPSCs 紧紧包裹着管状结构（图4 a）。相比之下，添加 INHBA 敲低的 DPSC 使血管样结构的厚度和连接面积相比 NC‐DPSC‐seeded 组减少，说明敲低 Activin A 会抑制血管稳定性。此外，当 HUVECs 与 INHBA 敲低的 DPSCs 共培养时，血管样网络的稳定性被破坏，这表明 Activin A 在稳定预形成血管结构中的重要性。

图4     添加NC-DPSC和Activin A敲低DPSC后，稳定已有的血管样结构。

综上所述，Activin A 在 DPSC-HUVEC 共培养过程中介导血管形成和稳定，发挥重要作用。Activin A 通过增强 VEGFR1 表达，减少 VEGFR2 的磷酸化，微调 VEGF 活性，从而抑制 HUVECs 的血管生成反应（图4 b）。该研究拓展了我们对 HUVECs 与 DPSCs 之间旁分泌相互作用的理解，后者有望成为促进牙髓再生中血管组织工程的潜在分子靶点。

参考文献：
Zhong J, Zhang Y, Lin S, Kang J, Hu M, Liu J, Chen Y, Jiang Q, Zhang C. Activin a regulates vascular formation and stabilization in direct coculture of dental pulp stem cells and endothelial cells. Int Endod J. 2025 Jul;58(7):991-1005. doi: 10.1111/iej.14226. Epub 2025 Mar 19. PMID: 40106315; PMCID: PMC12160993.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40106315/或点击阅读原文
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