在流式细胞术中，对细胞内蛋白靶标进行染色通常需使用固定剂和破膜剂。固定剂用于稳定细胞结构、维持形态完整性，而破膜剂则在细胞膜上形成微孔，使抗体能够进入胞内结合目标蛋白。这一处理不仅有效暴露细胞内抗原，便于特异性染色与检测，还能保留已结合在膜表面蛋白上的荧光信号（如表面标记抗体），前提是选用兼容的固定与破膜试剂。合理选择固定破膜体系，对于同步分析细胞表面与胞内蛋白、实现多参数精细表型分型至关重要。

问题发现

研究人员在CD4-Cre × Rosa26-EYFP（CD4/EYFP）小鼠脾细胞中观察到，未经处理的活细胞EYFP荧光信号最强；然而，使用FoxP3染色试剂盒（含Fix/Perm和Perm两步法）后，EYFP荧光几乎完全消失。值得注意的是，若在标准染色流程前先用2%多聚甲醛（PFA）进行预固定，则EYFP信号可有效保留。

这一现象表明，荧光丢失并非源于荧光蛋白的化学降解，而是由于Fix/Perm缓冲液固定能力不足，导致可溶性胞质EYFP在后续破膜和洗涤步骤中被被动洗脱出细胞。

怎样解决

为解决转录因子（TF）染色过程中报告荧光蛋白信号丢失的问题，研究人员首先在CD4-Cre × EYFP小鼠脾细胞中比较了不同固定/破膜方案。进一步实验显示，Fix/Perm处理后的上清液中蛋白含量显著高于Triton X-100处理组，且通过抗GFP抗体捕获法可在Perm处理后的上清中检测到EYFP，但在先经Fix/Perm处理的样本中则无法检出——说明EYFP主要在Fix/Perm步骤中因固定不充分而泄漏。这些结果共同证实：荧光丢失源于固定强度不足，而非荧光团降解。

尽管2%多聚甲醛（PFA）固定能有效保留EYFP荧光，但FoxP3染色的强度和阳性细胞比例却明显下降。同样，CD8⁺ T细胞中T-bet的染色也显著减弱。在已知均一表达RORγt的双阳性（DP）胸腺细胞中，PFA固定严重削弱了RORγt信号；然而，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠中枢神经系统浸润的CD4⁺ T细胞中，IFN-γ和IL-17A的细胞因子染色在各种胞内染色方法下表现相似。为平衡荧光保留与转录因子检测，研究人员降低PFA浓度并调整固定时间，随后使用试剂盒的Perm缓冲液进行破膜。结果显示，延长固定时间虽可提升EYFP信号，但荧光恢复仍有限，且伴随FoxP3染色显著损失，表明单纯调节PFA条件难以兼顾两者。

破局关键方法

研究人员尝试使用含少量甲醇的液体甲醛配制的2% FA固定剂，固定40–60分钟后结合Perm破膜染色，取得了理想效果：EYFP荧光信号清晰、阳性率与未处理组一致；FoxP3、T-bet和RORγt染色效率完全恢复，强度媲美标准方案；同时细胞FSC/SSC形态更佳，表面标志物（如CD4、CD8）保留更完整，整体回收率优于商业试剂盒。该方法亦适用于tdRFP报告小鼠——在EAE模型中，91%的中枢浸润CD4⁺ T细胞仍保持RFP阳性，并可同步检测RORγt、IL-17A和T-bet表达。

完整操作流程

本研究推荐一套标准化流程，用于在保留荧光报告蛋白的同时高效染色转录因子或细胞因子。

若需检测细胞因子

先用PMA（50 ng/mL）和离子霉素（500 ng/mL）刺激细胞4小时，并加入布雷菲德菌素A（1 μg/mL）阻断蛋白分泌。

随后进行表面染色：先以Fc阻断剂（2.4G2克隆，5 μg/mL）处理10分钟，再于4°C避光孵育15分钟，使用含1% BSA和0.1% NaN₃的DPBS缓冲液配制抗体，常用组合包括CD90.2、CD4、CD8、CD25、CD11b和CD45.2等标记。

固定步骤采用2%甲醛（FA，由含<3%甲醇的4% Roti-Histofix稀释），室温孵育40–60分钟。破膜与胞内染色使用0.1%皂苷缓冲液或1×Perm缓冲液，加入抗FoxP3、T-bet、RORγt、IL-17A或IFN-γ等抗体，4°C避光染色30分钟至过夜。

最后用相同破膜缓冲液洗涤两次，重悬后通过流式细胞仪采集数据。该方案兼顾报告荧光稳定性与核/胞质蛋白染色效率，适用于多参数精细免疫表型分析。

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