在使用单细胞测序研究血液肿瘤时，研究人员常面临一个问题：恶性肿瘤细胞与正常细胞在样本中毗邻共存，要精准解析恶性克隆，需要同时获取单细胞的转录组全貌与基因突变类型。短读长测序虽可获得表达谱信息，却由于读长限制难以捕获位于基因远端的致病突变，例如驱动慢性髓系白血病（CML）的BCR::ABL1融合转录本，以及肥大细胞白血病相关的KIT基因点突变，在标准的短读长测序中检出率极低。

针对这一痛点，来自瑞典卡罗林斯卡医学院的研究团队于今年5月在bioRxiv上发布了一篇题为“Integrated analysis of leukemic mutations and transcriptomes at the single-cell level ”的预印本文章，研究人员通过设计靶向引物对10x Genomics 3’单细胞工作流程中的全长cDNA扩增中间产物进行半巢式PCR富集，结合PacBio长读长测序，成功捕获了KIT基因远端点突变及BCR::ABL1融合转录本。通过混合细胞系进行方法学验证显示该方法对突变阳性细胞的阳性预测值高达98%以上。对CML患者样本进行检测，结果显示在单细胞分辨率下直观捕捉到大量存在的BCR::ABL1克隆，以及治疗后恶性转录本的清除。使得单细胞转录组检测从“表达谱描绘”向“精准克隆溯源”迈进。

1 靶向富集结合长读长测序大幅提升

白血病关键突变检出率

研究者将携带BCR::ABL1融合基因的Ku812细胞系与携带KIT双点突变（V560G和D816V）的HMC1.2细胞系进行Hashtag标记混合后进行单细胞转录组测序。在标准短读长数据中可检测到两种细胞差异表达的转录组及目标基因，但对于白血病相关的BCR::ABL1融合转录本和KIT基因突变的检出量仅为个位数，存在严重漏检。针对这一瓶颈，研究人员为每个突变位点设计靶向引物，对10x Genomics 3’单细胞工作流程中的全长cDNA扩增产物进行半巢式PCR靶向富集以捕获KIT突变位点，通过Sanger测序辅以验证后进行PacBio长读长测序，同时读取突变位点、Cell Barcode和UMI信息。设定严格阈值区分背景噪音后，HMC1.2中c.1679突变细胞占比3%、c.2447占比跃升至19.8%，而假阳性率仅0.024%和0.307%，阳性预测值分别高达99%和98%。背景噪音分析显示，非目标位点的spurious突变率仅0.07%和0.013%，远低于真实突变信号。综上，该策略实现了单细胞水平上转录组与远端突变的同时高灵敏度分析。

图1 长读长测序在HMC1.2细胞中检测单细胞水平的KIT突变

白血病融合基因

在成功验证KIT点突变检测后，研究人员将靶向长读长测序策略迁移至BCR::ABL1融合基因检测。研究者设计了跨越BCR基因断裂点的引物，对单细胞全长cDNA产物进行靶向富集，再进行长读长测序分析。设定阈值区分背景噪音后，Ku812中BCR::ABL1阳性细胞占比4.3%，而假阳性率仅0.077%，阳性预测值高达99%。对野生型BCR的检测结果显示，HMC1.2阳性率为7.9%，而Ku812仅0.165%，与Ku812本身不表达野生型BCR的已知特性完全吻合，从侧面验证了检测的特异性。该策略成功实现了单细胞水平融合基因与转录组数据的无缝整合，为慢性髓系白血病的单细胞研究提供了可靠的基因分型工具。

3 单细胞转录组长读长测序精准捕获

白血病致病突变与治疗响应

在细胞系验证成功的基础上，研究者将方法应用于慢性髓系白血病患者的变异检测，分别于治疗前后采集外周血白细胞进行分析。单细胞转录组数据鉴定出了淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等细胞群体，并在两个时节点均检测到BCR和ABL1基因表达。对两时间点的全长cDNA进行BCR::ABL1靶向富集和长读长测序，结果显示，治疗前检测出BCR::ABL1融合信号，治疗期样本融合信号消失，与临床PCR数据（初诊41%，治疗期0.1%）完全吻合。该方法成功在患者样本中实现了单细胞水平的致病突变追踪与治疗响应评估。

这项研究为使用单细胞转录组数据进行融合基因与点突变检测补上了关键的一环，其在CML患者样本中的成功验证，让我们在单细胞分辨率下直观看到了恶性转录本的清除过程，从初期遍布不同细胞类群的融合信号，到治疗后的信号归零。这套更灵敏的检测方法为血液肿瘤及其他涉及组织嵌合体疾病的单细胞研究提供了一把新的钥匙。

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参考文献

1. Sofia Papavasileiou, Chenyan Wu, Daryl Boey, Lucille Margerie, Jiezhen Mo, UllaOlsson-Strömberg, Stina Söderlund, Gunnar Nilsson, Joakim S. Dahlin. bioRxiv. (2026). doi: https://doi.org/10.64898/2026.05.06.723232