冻干工艺预冻阶段退火的操作方法及对产品产生的作用
2026-07-07 来源:本站 点击次数:19关于退火，你想知道的“一切”？
冻干工艺分为三个阶段：预冻、一次干燥、二次干燥；“退火”是预冻阶段的一个常用操作。具体的操作方法为：
- 在预冻样品的过程中，将冷冻完成的样品加热到一个高于玻璃态转变温度（Tg’）低于初始融化温度的条件下；
- 在这个温度条件下保持一段时间；
- 再次降低温度，降低到要求的冷冻温度；
退火有可能对产品产生以下作用：
大冰晶数量增加，小冰晶数量减少；
- 晶体比例增加，消除“重结晶”现象对后续产品稳定性的影响；
- 破瓶现象将会减轻；
- 某些情况下，能够缓解或者消除结壳现象；
- 延长了预冻时间；
虽然读了文章，但回到工作中却常常是：对着自己产品，还是不知道具体该怎么做；
“高于玻璃态转变温度低于初始融化温度，把产品放到DSC测一下这两个参数，中间的区间常常有十几二十度，甚至更宽，那我到底，该选择哪个温度？”
“做了退火，产品却没有改善，是我的工艺条件设置的不对么？是温度不对，还是时间不对呢？”
“退火这个工艺，是否对我的产品不适用呢？”
“其他同类产品的工艺都有退火，那我就也加一个吧，至于对产品有什么影响，并不太清楚；”
等等………..
那么我希望通过今天这个系列的文章，把退火一次讲清楚；
知其然、知其所以然，面对任何产品都可以“设计对应的实验参数”；
获得“合适”的实验数据，以进行评估；
将“退火”这个操作，在自己的产品上运用自如；
预冻过程及完成时，你的样品的组成：
| 理想模型 | 实际情况 | 原因 | 后续影响 |
| API | API | - | - |
| 冰晶 | 随机分布的大冰晶、小冰晶； | 过冷温度不同； | 最终产品外观不均一； 一次干燥时间很长； 最终产品水分结果不均一； |
| 晶态辅料 | 充分结晶的晶态辅料+ 未完成结晶的晶态辅料 |
快速降温，导致来不及完全结晶； | 体系Tg’降低； 一次干燥、二次干燥、存储过程中发生重结晶； |
| 最大浓缩非晶态浓缩溶液； | 非最大浓度浓缩溶液； 被包裹的水； 来不及析出形成晶体的水； 来不及析出的晶态辅料； |
降温过程中，水和晶态辅料来不及从浓缩溶液中析出完成结晶； | 一次干燥完成后，水分仍然较高，导致二次干燥需要更长时间； 体系Tg’降低； |
| 吸附水、结合水 | 吸附水、结合水； | - | - |
| 样品均一完成预冻 | 预冻从下往上发生； 或从左往右、从右往左发生； |
随机 | 溶质浓缩相迁移； 结壳、开裂等外观； |
晶体、无定形物质在预冻过程中的物理化学变化（一）
晶体、无定形物质的混合物在预冻过程中的物理化学变化（二）
这两篇的内容我觉得对于理解冻干的实际情况非常重要，阅读量都并不高；
但其实这两篇是冻干工艺中，很多操作的基础；
理解本篇内容的前提，需要先理解以上两篇；
知识的积累是层层递进的，我们的线下课，会带你一次从0基础，走到成功放大；
如果阅读公众号文章的话，需要一层层按顺序学习；
目前的公众号，大概写出了线下课内容的30%吧；
层层递进的关系没有理顺，基础没有理解透彻，后续的实践就很容易出现偏差；
退火的本质是什么？
操作：在预冻样品的过程中，将冷冻完成的样品加热到一个高于玻璃态转变温度（Tg’）低于初始融化温度的条件下；
图一：预冻阶段的退火示意图
- 预冻完成后，形成的结构为：冰晶镶嵌在非晶态浓缩溶液中（无定形处方）；
- 预冻温度低于浓缩溶液的玻璃态转变温度，因此浓缩溶液表现为刚性状态；
图二：冻结过程中冰形成、溶质结晶、共晶点和玻璃化转变的理论相图。
玻璃态转变温度Tg’，是表达样品中浓缩溶液流动态的一个指标；
高于此温度，则样品中的浓缩溶液为橡胶态（具有一定流动能力）；
低于此温度，则样品中的浓缩溶液，为刚性状态（无法流动）；
- 退火这个步骤，实际是在样品具有一定流动（但并没有完全融化为液体）可能的情况下，给样品提供一定的能量；
- 这个能量的总量为：热量乘以持续时间的一个总数值；
- “能够移动+有能量”在这个条件下，冰晶和非晶态基质有了结构改变的驱动力和可能性；
基于预冻完成之后，样品的实际组成情况，结合样品组分在微观层面的可移动性+退火给予的能量。
从动力学的角度：
根据Gibbs-Helmholtz的晶体表面能理论：在等温等压条件下系统分散度越大，就更加不稳定；
具有巨大表面积的系统是热力学不稳定系统；
无论晶体还是非晶态物质，在固定体积的条件下，都将朝着总表面积更小的方向发展；
表面积自由能较大的：小冰晶、片状、层状冰晶，朝着表面积自由能较小的：柱状、球状大冰晶方向发展；
这是退火过程中，晶态和非晶态物质改变的最根本推动力；
样品组分在微观层面的可移动性和退火给予的能量，使得这种改变成为可能；
冰晶和晶体辅料：
退火过程中，冰晶受化学势驱动移动和变化；
*粒子总是从高化学势向低化学势区域、相或组元转移；
化学势与晶体粒子曲率半径之间的关系式如下：
曲率半径小的冰晶有较高的化学势；
曲率半径较大和有负曲率半径的冰晶化学势较低；
退火过程中，有着较高化学势的曲率半径小的冰晶则朝着低化学势曲率半径较大的冰晶移动和重组；
图三：快冻、慢冻两种预冻条件下，加入退火后，产品内部结构变化
这个过程中，小冰晶生成大冰晶；
未冻结水和熔融液也发生重结晶；
小冰晶、片状、层状冰晶朝着柱状、球状大冰晶方向发展；
冰晶尺寸从临界半径增大至稳定状态下的半径时，重结晶结束；
未能彻底完成结晶的结晶辅料（如甘露醇），也在此时完成结晶；
结晶结束，退火完成；
这个时间即为在这个板层温度下，退火需要持续的时间；
*实验数据显示，退火温度越高则需要的退火时间越短，但目前并没有建立有效的退火温度和持续时间之间的数学公式；
非晶态基质（无定形浓缩溶液）
退火过程中，Tp高于Tg’，非晶态基质的粘度随着温度的升高而降低；
更低的粘度下，分子间相互运动的摩擦阻力减小；
被非晶态基质包裹的晶态辅料被释放，完成结晶；
被非晶态基质包裹的液态水被释放，完成结晶；
前者常常使得体系的关键温度提高，从而为一次干燥的产品温度释放出空间；
后者使得二次干燥阶段需要去除的水分减少，从而使得二次干燥变得更容易；
预冻阶段溶质浓缩和相分离
预冻阶段，冰晶从下向上生长或者从左至右、从右至左；
冰晶生长过程中，非晶态基质（浓缩溶液）还具有流动性，因此被冰晶的生长赶向溶液最上层；
形成下面溶质少，上层溶质多的情况，严重时为我们看得见的“结壳”；
预冻到一次干燥的升温阶段，因为顶部溶质富集，热膨胀被西林瓶壁阻挡，则可能发生开裂；
退火使得溶质分子具有了一定的移动性，持续一定的时间溶质从高浓度向低浓度迁移，从而有可能减缓或消除开裂和结壳；
退火有可能给产品带来的变化：
| 组分 | 未退火 | 退火后 | 可能性 | 后续影响 |
| API | API溶质迁移 | 溶质分布更均一 | 中等 | - |
| 冰晶 | 随机分布的大冰晶、小冰晶 | 小冰晶变为大冰晶 | 较高 | ●最终产品外观均一（但可能较粗糙）； ●一次干燥时间缩短； ●最终产品水分较高（比表面积小）； |
| 晶态辅料 | 充分结晶的晶态辅料； 未完成结晶的晶态辅料； |
晶态辅料充分结晶 | 较高 | ●碎瓶的概率降低； ●一次干燥、二次干燥、存储过程中不发生重结晶； ●体系Tg’提高； |
| 最大浓缩非晶态基质（浓缩溶液）； | 玻璃态非晶态基质中包含： ●来不及析出形成晶体的水； ●来不及析出的晶态辅料； |
包含在非晶态基质中的：水、晶态辅料被释放，且完成结晶； | 中等 | ●二次干燥较为容易； ●体系Tg’升高； |
| 吸附水、结合水 | 吸附水、结合水 | 吸附水去难比例变小； | 较高 | 退火后，二次干燥阶段产品比表面积小，吸附水较难去除，从而最终水分较高； |
| - | 溶质浓缩，富集到顶部； | 溶质分散更均一 | 中等 | 减缓或者消除结壳、开裂； |
我们还需要知道的（非常重要）：
以上，我以尽量清晰的逻辑，解释了退火对我们产品的影响；
但理解以上内容，还需要附加的一个非常重要的思维是：这些都只是一种可能性；
还有很多的内容，因为篇幅的限制，无法展开；
比如退火对于含有晶体辅料的无定形处方Tg’提高的作用，不是增加了这一个步骤，就一定可以提高；
这又和晶体辅料和无定形辅料的配比有关；
图四：蔗糖、甘氨酸不同配比处方，退火对Tg’的影响
或者，虽然Tg’有提高，但幅度很小；
图五：蔗糖、甘露醇不同配比处方，退火对Tg’的影响
而且，退火过程本身也会造成冷冻浓缩液的相分离，从而浓缩液中的蛋白质在固液界面处有发生变性的风险；
退火本身也要消耗时间，如果对产品或者总工艺时长没有明显改善，则不要添加此步骤；
总之，这是一个需要通过实验数据去确定是否需要添加的步骤；
而不是所有的冻干工艺都增加“退火”；
最后的话：
- 退火是一个发生在高于Tg’，低于产品初始融化温度的温度区间的过程；
- 退火的本质，是在样品分子具有一定移动性的前提下，给样品提供一定的能量；
- 在以上前提下，样品中的不同组分：从高化学势向低化学势的区域、相转移；
- 退火温度、退火时间共同影响着提供的能量；
- 退火有很多的优点，但并不意味着每个产品的冻干工艺都要加入此步骤；
- 在工艺中是否加入退火，始终需要基于针对你的产品的实验数据；
- 我们需要深入理解冻干工艺中的每一个参数对产品方方面面所产生的有可能的影响，退火也是同样；
- 我们需要，让冻干工艺的每一个参数都“有据可依”
特别感谢TELSTAR一直以来提供LYOBETA系列中试冻干机，在任何时候都为我提供数据和实验支持；
特别感谢昊扩科技，提供冻干显微镜、DSC设备、实验人员以及其他财政支持.
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[5] Wei Wang Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals International Journal of Pharmaceutics 203 (2000) 1–60
文章来源——冻干工艺之家公众号 • 星德科 TELSTAR 冻干工艺实验室
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