摘要
CLIP-seq 是研究 RNA 结合蛋白和靶 RNA 之间体内的相互作用的重要测序技术，在整个实验过程中要经过紫外交联、恒温孵育、核酸杂交、酶促反应以及样本灭活灭菌等多个步骤的操作，传统的实验方式需要使用到紫外交联仪、分子杂交炉、恒温摇床和紫外消毒器等多种独立的仪器，并且存在占地面积大、样本转移容易造成污染、实验重复性差以及人工成本高等问题。
本文主要讨论的是关于集成式多功能分子处理一体机的相关内容，从整体上对它的功能结构进行说明，并且详细阐述了它所采用的一体化技术逻辑来完成整个 CLIP-seq 实验的过程，在此基础上加入了内置灭菌模块以达到防止污染的目的，然后把该设备和现有的分立式的设备做比较之后再论证出一台集成式的仪器可以带来更高的工作效率、更好的质量控制效果以及更安全的工作环境的优势，在最后部分给出有关于 RNA 组学或者转录调控相关的实验室中应该选择什么样的设备作为建议。

关键词为：CLIP-seq、RNA结合蛋白、一体化分子仪器、核酸污染控制、紫外线消毒、分子杂交

一、CLIP-seq 传统的实验体系所遇到的设备限制
CLIP-seq 技术利用紫外线共价交联来捕捉细胞内的 RBP-RNA 复合物，并经过酶切、免疫沉淀、核酸洗脱、接头杂交以及反转录建立文库之后再进行高通量测序，在整个过程中涉及到很多精密的温度控制和光照处理单元。

• 标准的 CLIP-seq 操作至少要使用五种不同的仪器共同协作完成：

第一种是 254nm 紫外共价交联仪用来对细胞或者组织样品进行原位交联固定蛋白质-核酸相互作用；
第二种是恒温旋转杂交仪来做预杂交、RNA 接头连接以及酶促孵育等一系列长时程等温反应；
第三种是低温振荡混匀装置可以适用于磁珠免疫沉淀全过程；
第四种是有控核酸定量及温度调节模块来控制 RNase 和蛋白酶 K 的消化过程；
第五种是独立紫外灭菌操作台在实验前后对腔体、耗材和样本试管中的核酸降解以及微生物灭活。

• 分立式的设备体系有三个主要的问题：

第一是样本要经过多次跨越不同设备的过程，在此过程中RNA很容易被降解或者受到交叉污染，并且微量互作复合物也会因此而丢失掉，从而使得测序文库的信噪比下降很多，大量的无效峰和假阳性结合位点就会产生；
第二是因为多台设备占据了实验室很大的工作台面积，所以中小规模的研发平台在购买以及维护这些设备上所花费的成本就变得非常高昂了；
第三是各个设备对于温度控制、紫外线照射强度以及旋转速度的标准都不一样，在人工操作的过程中产生的误差就会逐渐积累起来，而且组与组之间进行同样的实验时的一致性也无法达到高水平期刊的质量控制的要求；
第四是CLIP-seq 样本中含有活性细胞和病原体的核酸片段，在做完实验之后如果不能及时地把所有的耗材和腔体里面的残留核酸都彻底地灭活掉的话，那么它将会一直对后面的样品造成污染；
第五是常规单一的紫外灯只能起到局部杀菌的作用，并没有一个完整的闭环式的灭菌流程来支持大规模连续性的实验。

二、一体化多用途分子仪器的核心功能结构包括CLIP-seq整个过程
新型集成式的分子处理一体机采用了模块化的内嵌方式，把紫外交联、恒温旋转杂交、低温振荡孵育和全腔紫外灭菌这四个主要的部分都放在一个台式机里边了，并且各个部分之间是分开的，可以单独工作也可以一起用，整个过程都可以在一台机器上完成CLIP-seq的所有步骤，不需要换仪器也不需要移动样品。
2.1 CLIP-seq 特殊的功能模块

• 可以调节的能量紫外交联体

内置了254纳米的标准紫外灯管，并且可以调节到能量范围为0-800mj/cm²之间，以满足对细胞、新鲜组织和冰冻切片三种不同类型的样本进行交联的需求，在腔体内使用的是不锈钢反光层来保证紫外光线能够均匀地照射到所有的地方上，从而消除了照射盲区的问题。相比于传统的外置式交联仪而言，本设备不需要把样本从一个容器转移到另一个容器中去，在完成交联之后就可以直接进入到恒温孵育程序当中去了，这样就避免了RNA暴露在外而受到降解的风险，在CLIP-seq的第一步共价结合捕获过程中表现得非常出色。

• 多种方式恒温旋转杂交装置

温控范围为4-75摄氏度，并且可以实现连续调节，在低速运转和往复振动两种方式中选择使用，适用于磁珠孵育、核酸预杂交、蛋白酶K消化、逆转录等多种CLIP反应。腔体内设有不同尺寸的离心试管夹具，一次最多可以处理1到32个样品，采用热风循环控制温度变化不超过正负0.3摄氏度来避免传统水浴杂交时出现温度不均匀以及水分蒸发造成的样本损失问题，并提高了免疫沉淀复合物回收率。

• 微量酶反应精确控温装置

独立低温子腔可以保持4-10℃的低温条件，适用于RNase T1 限制性酶切、抗体磁珠结合等低温实验；高温区可以在短时间内把温度升到55-65℃左右，完成蛋白质水解和RNA洗脱等工作，在一个装置里就可以实现CLIP-seq所有的酶促步骤所需要的温度变化。

• 全域闭环灭菌处理单元

仪器内设了两个通道的254纳米紫外线灭菌系统和臭氧降解程序，在实验之前进行预消毒，在实验之后做终末灭菌处理。设备腔体、样品托盘以及管道均使用耐紫外不锈钢材料制成，并且在灭菌模式开启之后会自动关闭腔室，用以对整个腔室内环境进行30-60分钟的全空间紫外照射来消灭可能存在的自由基核酸分子，并通过臭氧循环清除掉腔室内残留的有害物质，从而避免二次污染的发生。

此外还可以对耗材进行就地灭菌操作，在完成所有实验之后只需要按下一次灭菌按钮就可以使离心试管和杂交支架等部件免受外界细菌侵扰而造成交叉感染的风险，并有效防止CLIP-seq实验过程中由于微量核酸残留所引起的测序背景噪音问题。

三、一体化仪器和传统的分立式的设备相比，在使用上具有很多的优势
3.1 增加实验数据可信度、减少操作误差
CLIP-seq 对于RNA完整性的要求很高，并且对于反应条件的一致性也有很高的要求，在传统的多台设备的操作方式下需要人工多次地转移样品、反复地设定温度和紫外参数，这样的人为误差将会对RBP结合信号造成很大的影响。
而一体化仪器内部已经设置了标准化的CLIP-seq预设程序，在交联、孵育、酶切、灭菌等整个流程中所有的参数都会被联动锁定起来，整个过程都是密闭的状态并且没有打开过的地方进行转移，因此RNA降解率可以降低到百分之六十以上，免疫沉淀复合物的富集效率也会提高百分之二十五左右，测序的有效读取比例也会得到明显的改善，在不同批次之间做实验的时候也可以保证转录组学定量分析的标准。
3.2 压缩实验室面积、减少整体的研发费用
一台集成设备可以代替四套独立的紫外交联仪、分子杂交炉、恒温摇床和紫外消毒台等仪器，在不增加占地面积的情况下为小规模研究室或者课题组提供一个独立的工作空间，并且在长期使用过程中只需要一次校准和每年一次全面检查就可以完成所有的维修工作，相比起多台设备分别购买并定期进行保养的方式来说，硬件购置费以及消耗品更新费用加起来能节省大约百分之四十的研发预算开支。
3.3 建立起一套标准的生物安全防护系统
CLIP-seq 实验所用的样品包括了细胞裂解液、内源核酸以及可能带有病原微生物的其他物质，在传统的检测设备中没有灭菌的功能，因此实验产生的废物和腔体内遗留下来的核酸需要被转移到一个经过灭菌的平台上进行处理，并且存在气溶胶传播的风险。
一体化仪器把整个实验过程和灭菌的过程都做成了一个封闭系统，在实验完成后只需要按一下按钮就可以对整个系统的全部区域进行消毒并且彻底消除掉所有的核酸和生物活性物质，不需要再有人工二次搬运的操作步骤出现，而且也完全符合分子生物学实验室生物安全二级的要求，可以避免由于核酸污染或者生物安全事故而造成的危害。

四、应用场景及研发落地的价值
在RNA结合蛋白的功能机理研究、RNA表观遗传学修饰以及非编码RNA调控等方面的研究前沿领域里，CLIP-seq起着不可替代的重要作用，并且可以很好地配合到细胞生物学、分子医学、肿瘤转录调控和微生物RNA相互作用等多个学科的研究当中去。

• 对于高校的重点实验室或者生物医药研发公司来说，它可以用来做基本原理的研究以及新药靶标的发现，在小样本初步试验的同时也可以进行大规模批量样品的检测分析。
• 以研发工程师的角度来看，该设备把复杂的分子实验操作过程简化为简单的几步，并且减少了反复调整仪器和运送标本的工作量，使研究人员可以把更多的注意力放在实验的设计上、数据分析以及机理的研究上面，从而提高研究工作的效率。
• 标准的操作记录可以被保存下来并且随时调用出来，在基金项目的验收、学术论文的方法学质量控制以及制药公司的研发数据符合要求等方面都起着重要的作用。

五、总结与展望
CLIP-seq 技术一直受到多台设备配套使用、样品交叉污染以及操作复杂等问题的影响而难以普及开来，在一个可以完成整个 CLIP-seq 流程并且具有全范围灭菌功能的一体化分子仪器中加入集成 CLIP-seq 全过程处理和全域灭菌的功能之后，通过模块化的组装方式来实现交联、杂交、酶孵育以及闭环灭菌等功能于一体的操作系统，从而在实验稳定性的角度上打破传统的实验体系限制，在空间成本方面也有所改善，在生物安全性方面更是得到了极大的提升。
这样的集成式设备代表着分子生物学仪器小型化、一体化和安全化的前进方向，在自动化吸取技术以及高通量核酸定量模块不断更新换代的过程中，将会使 CLIP-seq 整个流程实现无人值守的状态，并且给 RNA 互作组学的基础研究以及转化医学的研发带来更加高效、标准的硬件支持。