酶联免疫斑点实验(ELISPOT)技术原理、标准化实验流程及应用价值探析
2026-07-09 来源:本站 点击次数:34酶联免疫斑点检测（Enzyme-linked immunospot Assay，ELISPOT）是一项高灵敏度的单细胞检测技术，核心用于精准识别并定量检测单细胞分泌的细胞因子与抗体。该技术依托特异性单克隆抗体对细胞分泌的目标细胞因子进行捕获，再通过酶促斑点显色反应，让微量细胞因子转化为肉眼可观测的特异性斑点，以此实现对功能性分泌细胞的精准计数。
ELISPOT技术凭借超高检测灵敏度、单细胞精准定位、操作便捷、实验成本经济等核心优势，在免疫学研究、疾病临床诊断、疫苗研发与效果评估等多个科研及临床领域广泛应用。其中IFN-γ ELISPOT检测体系，是目前行业内公认的评估疫苗诱导机体产生细胞免疫应答效应的权威“金标准”。通过定量检测IFN-γ的分泌水平，可间接判定辅助性T细胞的活化与功能状态，为机体免疫反应机制研究、免疫效果评估提供关键数据支撑，具备极高的科研参考价值。
1、抗体包被处理
（1）采用无菌无钙镁离子PBS（DPBS）体系，将包被抗体稀释至15μg/mL的标准工作浓度，备用。
（2）取96孔PVDF专用培养板，进行孔板活化处理：每孔加入15μL 35%乙醇静置2min，或加入等量75%乙醇作用30s，完成后弃去孔内液体。随后每孔加入200μL无菌ddH2O洗涤3~5次，彻底去除残留乙醇，洗涤完毕弃液，将孔板倒置在无菌吸水纸上轻轻扣干残留水分。
（3）向每孔加入100μL配制好的包被抗体稀释液，将孔板置于4~8℃环境中恒温孵育过夜，保证抗体充分结合孔板膜面。
弃去孔内包被液，用PBS缓冲液洗涤孔板5次，无菌吸水纸轻轻扣干孔内残留液体。每孔加入200μL 1% BSA封闭液，置于37℃恒温环境中封闭1h，阻断孔板非特异性结合位点，孵育结束后弃去封闭液。
提前配制实验所需刺激物，常用体系及配制要求如下：2X CEF多肽库需先用纯DMSO充分溶解，再用1XPBS稀释至实验所需终浓度，严格控制DMSO终浓度＜1%，避免高浓度有机溶剂引发细胞毒性，影响实验结果；2X PHA刺激物则取5mg PHA凝集素，加入1mL无菌DPBS或完全细胞培养基轻柔吹打混匀溶解，再通过无菌缓冲液稀释至标准工作浓度，全程禁止过滤处理，防止刺激物损耗失效。
实验需设置完整对照体系，排除实验干扰：设置PHA刺激阳性对照组、每个待测样本单独设立无刺激物阴性对照孔，同时整块孔板增设空白背景对照（仅添加培养基及全套检测试剂，无细胞体系）。
（1）按照2~4×105个/100μL的细胞量进行每孔接种，接种后轻拍孔板边缘，使细胞均匀铺展于孔底。阳性对照孔加入10μL PHA溶液，调节体系终浓度为4μg/mL；背景对照孔加入100μL无血清培养基；实验样本孔分别加入对应刺激物与待测细胞悬液。将孔板置于37℃恒温培养箱中孵育16~20h，完成抗原刺激与细胞因子分泌过程，也可提前将细胞与刺激物混匀后统一接种入孔。
（2）培养结束后弃去孔内培养液，每孔加入200μL预冷去离子水，冰浴静置10min，通过低渗作用裂解孔内细胞。随后采用含0.05% Tween-20的PBS缓冲液洗涤孔板4~6次，彻底清除裂解的细胞残渣，每次洗涤用量200μL/孔，洗涤完成后用吸水纸轻轻拍干孔板。
（1）采用含0.5% BSA/FBS的PBS缓冲体系，将生物素标记检测抗体（荧光抗体亦可）稀释至1μg/mL工作浓度，每孔加入100μL稀释抗体，37℃恒温孵育2h，孵育结束后洗涤孔板5次。
（2）同样使用0.5% BSA/FBS的PBS缓冲液稀释链霉亲和素-HRP工作液，每孔添加100μL，室温避光孵育1h。注意：HRP结合物严禁与含叠氮化钠的缓冲液混用，避免失活；底物显色液配比需严格区分体系，AEC底物稀释比例为1:100，TMB底物稀释比例为1:500~1000。
（3）选用不含Tween-20的纯PBS缓冲液洗涤孔板4~6次，单次洗涤用量200μL，彻底去除未结合的反应试剂。
（4）每孔加入100μL TMB底物工作液，室温避光反应20~30min，直至孔内清晰出现特异性显色斑点。反应达标后加入去离子水终止显色，擦干孔板正反面残留水分，置于避光环境中静置过夜，确保孔板彻底干燥。
（1）采用ELISPOT reader仪器完成斑点成像与计数分析。
（2）启动配套分析软件，依次选择CTL→capture选项，匹配对应96孔板型号；点击eject弹出载物台，将孔板平稳放置并对齐A1孔位，点击load载入样本。通过Preselect Wells功能选定待检测孔位（支持整行、整列、单孔多选），进入image capture setting-exposure setting界面，勾选modify exposure time并调试合适曝光参数，保存设置后开启auto center for each well自动对位功能，精准对准各检测孔，点击star启动读板成像。
（3）进入数据分析模块，根据孔板斑点状态选择对应分析模式：背景干净、斑点清晰规整选择Normal模式；斑点弥散、存在轻微背景干扰选择Normal diffuse模式。计数模块优先选用smart count智能计数功能，同时开启quality control质控程序，完成精准斑点统计与结果分析。
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| 货号 | 产品名称 | 种属 |
|---|---|---|
| LXEHS01-1 | 人 IFN-γ 单色 Elispot (酶标) Panel 检测服务 | Human（人） |
| LXEHS02-1 | 人 IL-2 单色 Elispot (酶标) Panel 检测服务 | Human（人） |
| LXEMS01-1 | 小鼠 IL-2 单色 Elispot (酶标) Panel 检测服务 | Mouse（小鼠） |
乐备实（上海优宁维生物科技股份有限公司旗下全资子公司），是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务专家，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到单细胞测序、空间多组学、流式检测、超敏电化学发光、Luminex多因子检测、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫组化、DSP空间多组学等30多个，建立起了一套涵盖基因、蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。
原文点击：酶联免疫斑点实验（ELISPOT）
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