期刊：Advanced Science
影响因子：14.1
通讯单位：安徽医科大学第一附属医院
伯豪生物技术服务：单细胞转录组测序

导语
CD8+ T细胞能通过分泌干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等细胞因子，直接杀伤肿瘤细胞。但在肿瘤微环境中，持续的抗原刺激会让CD8+ T细胞逐渐分化为耗竭状态，形成两个关键亚群：终末耗竭CD8+ T 细胞（Tex）和祖细胞样耗竭 CD8+ T细胞（Tpex）。

Tex细胞会高表达PD-1、TIM-3等多种抑制性受体，分泌效应细胞因子的能力大幅下降，生存能力也显著受损，很难被免疫检查点抑制剂重新激活；而Tpex细胞具有干细胞样特征，是介导持久抗肿瘤免疫的关键，也是免疫治疗的核心响应群体，能持续分化为有杀伤能力的效应T细胞，还能对PD-1抑制剂、过继性细胞治疗产生有效应答。

因此，如何保护CD8+ T细胞的干性、阻止其向终末耗竭状态分化，成为提升肿瘤免疫治疗疗效的核心研究方向。DADA是临床应用多年的保肝药，安全性良好，同时也是丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）的有效抑制剂，此前研究发现其能通过抑制肿瘤细胞糖酵解发挥抗肿瘤作用，但它对CD8+ T细胞代谢和干性的影响，此前一直是未知领域。这也成为本次研究的核心切入点。

技术服务
10X单细胞转录组测序，流式细胞术，转录组测序等。
（单细胞技术服务由伯豪生物提供）

研究内容DADA的抗肿瘤效应，完全依赖CD8+ T细胞
首先在B16-F10黑色素瘤、MC38结直肠癌等皮下肿瘤模型以及B16-F10肺转移模型中验证了DADA的作用。结果发现，无论是预处理还是持续给药，DADA都能显著抑制肿瘤生长和转移，且这种效应并非单纯通过直接抑制肿瘤细胞增殖实现，即使在肿瘤接种前停止给药，DADA仍能有效抑瘤，说明其核心作用是调控宿主的免疫功能。进一步的细胞耗竭实验证实，当敲除小鼠体内的CD8+ T细胞后，DADA的抑瘤效应完全消失；而耗竭CD4+T细胞或NK细胞，并不会影响DADA的作用。这一结果明确了：DADA是通过特异性增强CD8+ T细胞的抗肿瘤应答发挥作用。
 

2. DADA阻止CD8+ T细胞终末耗竭，富集干细胞样Tpex细胞
为了探究DADA调控CD8+ T细胞的具体机制，对肿瘤浸润的免疫细胞进行了单细胞RNA测序，发现DADA处理后，肿瘤微环境中CD8+ T细胞的占比显著升高，且与T细胞活化、分化相关的基因被显著上调。通过流式细胞术进一步分析发现，DADA能显著降低肿瘤浸润CD8+ T细胞中PD-1+TIM-3+、TCF1-TIM-3 +等终末耗竭亚群的比例，同时大幅提升TCF1+TIM-3 - 的Tpex干细胞样亚群占比，还能降低耗竭关键转录因子TOX的表达，提高增殖标志物Ki67的水平。即使在体外通过持续的TCR刺激诱导CD8+ T细胞耗竭时，DADA也能以剂量依赖的方式抑制其终末耗竭，增强干性标志物Ly108的表达，这一效应在人外周血CD8+ T细胞中也得到了验证。
 

3. DADA通过PDK1依赖的方式，重塑CD8+ T细胞代谢
DADA是PDK的抑制剂，而PDK家族有PDK1-PDK4四个亚型。通过RNA测序发现，持续TCR刺激的CD8+ T细胞中PDK1和PDK3高表达，且DADA能特异性下调PDK1的表达；进一步的基因敲除实验证实，敲除PDK1能模拟DADA的效应，抑制CD8+ T细胞终末耗竭、增强其干性，而敲除PDK2/3/4 则无此作用，且在PDK1敲除的CD8+ T细胞中，DADA无法进一步发挥作用。这说明：DADA增强CD8+ T细胞干性的作用，完全依赖PDK1。

后续用药物阻断氧化磷酸化、抑制丙酮酸向线粒体的转运，或直接补充乙酰辅酶A时，发现阻断氧化磷酸化会完全抵消DADA的作用，而补充乙酰辅酶A则能模拟DADA的效应，这进一步证实了：DADA通过促进丙酮酸向乙酰辅酶A转化，增强氧化磷酸化和线粒体功能，进而提升CD8+ T细胞干性。
 

4. DADA显著提升多种免疫治疗的疗效，包括CAR-T细胞治疗
既然DADA能增强CD8+ T细胞的干性和抗肿瘤能力，在过继性细胞治疗（ACT）中，经DADA处理的OT-1 CD8+ T细胞回输到荷瘤小鼠体内后，肿瘤生长被显著抑制，且回输的T细胞在肿瘤微环境中具有更强的增殖能力，更少的终末耗竭细胞，更多的Tpex细胞，效应功能也显著增强。
 

在PD-1抑制剂治疗中，DADA与PD-1抑制剂联用，在MC38、B16-F10等不同免疫原性的肿瘤模型中，都能显著提升抑瘤效果，肿瘤浸润CD8+ T细胞的数量和增殖能力显著增加，Tpex细胞占比大幅提升。DADA处理能让靶向CD19的CAR-T细胞高表达CD62L、CCR7 等干性标志物，体外多次抗原刺激后，CAR-T细胞的PD-1、TIM-3等耗竭标志物表达显著降低，干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等效应分子的分泌显著增加；在Raji淋巴瘤异种移植模型中，低剂量的DADA处理后CAR-T细胞，就能实现更优的肿瘤控制效果，且CAR-T细胞在小鼠体内的持久性更强，耗竭程度更低，无明显组织损伤。
 

结论
本研究揭示了 DADA 在增强 CD8+ T 细胞介导的抗肿瘤免疫方面的潜力，并通过增加 Tpex 细胞群来提高免疫检查点阻断（ICB）和过继细胞转移（ACT）免疫疗法的效果。其通过 PDK1 依赖的方式重塑 CD8+ T 细胞代谢，增强干性、抑制终末耗竭的作用机制。本研究为CAR-T疗法的优化提供了切实可行的技术路径，有望推动CAR-T疗法在实体瘤治疗中取得突破性进展。

论文链接：DOI :10.1002/advs.202519765