RNA-BS在揭示通过m5C甲基化修饰促进胃癌进展功能中的应用
2026-07-28 来源:本站 点击次数:140
近日，上海交通大学系统生物医学研究院黄丽钰研究员团队在《Cellular Signalling》期刊发表题为“NSUN5-CBX8 m5C Axis promotes gastric tumorigenesis by activating JAK-STAT3 Signaling”的科研论文。研究利用RNA亚硫酸盐测序（RNA-BS）揭示了RNA甲基转移酶NSUN5在肠型胃癌（intestinal-type gastric cancer ,IGC）中的关键致癌作用及其分子机制。易基因RNA-BS技术助力揭示RNA甲基转移酶NSUN5通过m5C甲基化修饰CBX8促进胃癌（GC）进展的功能与机制。
研究团队通过构建组织特异性条件敲除小鼠模型，发现敲除Nsun5基因能显著抑制由Trp53 缺失和Kras突变介导的胃癌发生。研究整合运用了RNA亚硫酸盐测序（RNA-BS-seq）、RNA免疫沉淀（RIP）、CUT&Tag-seq及ChIP等技术，系统鉴定出CBX8 mRNA是NSUN5介导的m5C修饰的关键底物。NSUN5通过其m5C甲基转移酶活性，在CBX8 mRNA上添加m5C修饰，该修饰被reader蛋白YBX1识别，从而稳定CBX8 mRNA，增加其蛋白表达。CBX8作为多梳抑制复合体1（PRC1）的核心组分，通过表观遗传沉默 SOCS2 基因（JAK-STAT3信号通路的负调控因子），最终激活JAK-STAT3信号通路，促进胃癌进展。此外，研究证实CBX8特异性抑制剂SW2-110A能有效抑制NSUN5介导的肿瘤形成，为该通路作为潜在治疗靶点提供有力证据。
研究方法
（1）动物模型构建：Villin-Cre 小鼠与 Trp53fl/fl、KrasLSL-G12D/+、Nsun5fl/fl小鼠杂交，构建特异性敲除 Nsun5 肠型胃癌小鼠模型（NPK），并与未敲除的PK模型进行对比。
（2）转录组与表观转录组分析：
结果图形
（1）NSUN5促进肠型胃癌进展
研究发现，在TCGA数据库的胃癌患者中，NSUN5基因变化率在肠型胃癌中显著高于弥漫型胃癌，且与KRAS突变高度相关。为验证其功能，研究团队构建了Nsun5敲除的NPK小鼠模型。结果发现，与未敲除的PK小鼠相比，NPK小鼠在3月龄和6月龄时胃部肿瘤形成受显著抑制（图1C-D）。体外实验也证实在肠型胃癌细胞系中敲低NSUN5能显著抑制细胞迁移能力，提示NSUN5是KRAS突变肠型胃癌的一个关键驱动因子。
图1：NSUN5主要富集于KRAS变异的胃癌组织中，NSUN5敲除可有效抑制由Trp53缺失和Kras突变介导的胃癌发生
（2）NSUN5以m5C RNA甲基转移酶依赖方式显著调控JAK-STAT3信号
通过RNA-seq和GSEA分析，研究团队发现敲低NSUN5后，IL6-JAK-STAT3信号通路显著下调（图2A-B）。进一步实验证实，NSUN5敲低可以降低IL6诱导的STAT3磷酸化（p-STAT3）水平。野生型NSUN5可以恢复p-STAT3水平，而非催化活性缺失的突变体NSUN5C330A/C404A几乎完全丧失恢复能力（图2D），在小鼠肿瘤组织中也观察到类似现象（图2E-F）。表明NSUN5对JAK-STAT3信号调控完全依赖于其RNA甲基转移酶活性。
（3）NSUN5介导的m5C甲基化稳定CBX8 mRNA
为寻找NSUN5的直接靶点，研究团队进行了RNA-BS-seq，以单碱基分辨率鉴定NSUN5依赖性的m5C修饰位点。结果显示，NSUN5敲低后，m5C修饰在CDS区域的分布显著减少（图3B）。通过整合RNA-seq和RNA-BS-seq数据，发现CBX8是表达显著下调且CDS区m5C水平降低的关键基因。实验证实，NSUN5能结合CBX8 mRNA（图3G），并通过m5C修饰增加其稳定性（图3F）。进一步研究发现，m5C的reader蛋白YBX1能识别NSUN5介导的m5C修饰，并稳定CBX8 mRNA（图3I-J）。上述研究结果确立NSUN5→m5C修饰CBX8 mRNA→YBX1识别→CBX8 mRNA稳定的完整分子机制。
图3：CBX8被鉴定为GC中 NSUN5的m5C甲基化底物。
(A) Dot blot分别检测NSUN5敲低后及回补野生型NSUN5后MKN28细胞中的全局m5C水平。(B) RNA-BS-seq比较MKN28-shScramble与shNSUN5的m5C修饰全基因组分布。条形图和饼图展示不同RNA区域(内含子/编码区/5'UTR/3'UTR) m5C位点百分比。
(C) RT-qPCR分析NSUN5敲低后BS-seq中8个候选基因的mRNA水平。
(D) TCGA数据库中NSUN5与候选基因表达的相关性分析。
(E) NSUN5与CBX8表达在TCGA STAD队列中的相关性分析。
(F) MKN28-shScramble和shNSUN5细胞系中CBX8 mRNA半衰期分析(n=4)。
(G) 在表达外源性Flag-NSUN5的MKN28-shNSUN5细胞中，RIP实验显示与Flag-NSUN5结合的CBX8 mRNA水平。
(H) 回补WT或突变型MKN28-shNSUN5细胞的m5C RIP实验琼脂糖凝胶图像(左)和CBX8 mRNA水平定量分析(右)。
(I) MKN28-shScramble和shNSUN5细胞RNA pul-down实验，随后WB分析YBX1蛋白水平。
（4）遗传和药理学抑制CBX8可抑制JAK-STAT3信号
研究团队鉴定出CBX8是NSUN5的下游关键靶点后，随后通过遗传（shRNA敲低）和药理学（CBX8抑制剂SW2-110A）两种手段抑制CBX8功能。结果发现，两者均能显著抑制STAT3磷酸化，并抑制胃癌细胞的迁移能力。RNA-seq分析显示，SW2-110A处理后的细胞转录组变化与NSUN5敲低后高度相似，尤其是IL6-JAK-STAT3通路均被显著抑制。表明CBX8是NSUN5调控JAK-STAT3信号的关键效应因子。
（5）SW2-110A抑制Nsun5介导的Trp53缺失/Kras突变胃癌细胞肿瘤形成
为验证体内药效，研究团队将构建好的小鼠胃癌细胞原位注射到小鼠胃壁。结果显示，敲除 Nsun5的NPK细胞成瘤能力显著弱于PK细胞，而重构野生型NSUN5能完全恢复其成瘤能力。此外，经SW2-110A处理携带NPK+WT肿瘤的小鼠，能显著抑制肿瘤生长，且小鼠体重无明显下降，表明该药物具有良好的耐受性和治疗效果。
（6）CBX8-PRC1抑制IL6-JAK-STAT3信号的负调控因子SOCS2
为阐明CBX8如何激活STAT3，研究团队发现CBX8能特异性结合SOCS2的启动子（图4A）。SOCS2是JAK-STAT3信号的负调控因子。CUT&Tag实验证实，CBX8与PRC1作用于SOCS2启动子，介导抑制性组蛋白修饰H2AK119ub1和H3K27me3的沉积（图4C）。抑制或敲低CBX8后，这些抑制性修饰减少，RNA聚合酶II（PolII）结合增加，从而解除对SOCS2的转录抑制，导致SOCS2表达上调（图4D），进而抑制JAK-STAT3信号通路（图4I）。
结论和启示
本研究通过RNA-BS-seq、RNA-seq等分析揭示了NSUN5通过m5C甲基化稳定CBX8 mRNA，CBX8进而通过PRC1复合体表观遗传沉默 SOCS2，从而激活JAK-STAT3信号通路，促进肠型胃癌的发生发展。靶向CBX8的小分子抑制剂SW2-110A能有效阻断这一通路，抑制肿瘤生长。
RNA-BS在本研究中的重要作用
RNA-BS技术精准绘制了NSUN5介导的m5C修饰图谱，并直接定位到其关键靶基因CBX8 mRNA上的具体修饰位点，为研究RNA甲基化修饰的生物学功能提供强有力技术支撑。RNA-BS-seq可以作为未来鉴定和验证RNA甲基转移酶底物、解析表观转录组调控网络的核心工具。
参考文献：
Yin J, Li L, Niu Y, Wang Q, Liu W, Gu Y, Wang X, Huang L. NSUN5-CBX8 m5C Axis promotes gastric tumorigenesis by activating JAK-STAT3 Signaling. Cell Signal. 2026 Apr 29:112563. doi: 10.1016/j.cellsig.2026.112563.
研究团队通过构建组织特异性条件敲除小鼠模型，发现敲除Nsun5基因能显著抑制由Trp53 缺失和Kras突变介导的胃癌发生。研究整合运用了RNA亚硫酸盐测序（RNA-BS-seq）、RNA免疫沉淀（RIP）、CUT&Tag-seq及ChIP等技术，系统鉴定出CBX8 mRNA是NSUN5介导的m5C修饰的关键底物。NSUN5通过其m5C甲基转移酶活性，在CBX8 mRNA上添加m5C修饰，该修饰被reader蛋白YBX1识别，从而稳定CBX8 mRNA，增加其蛋白表达。CBX8作为多梳抑制复合体1（PRC1）的核心组分，通过表观遗传沉默 SOCS2 基因（JAK-STAT3信号通路的负调控因子），最终激活JAK-STAT3信号通路，促进胃癌进展。此外，研究证实CBX8特异性抑制剂SW2-110A能有效抑制NSUN5介导的肿瘤形成，为该通路作为潜在治疗靶点提供有力证据。
研究方法
（1）动物模型构建：Villin-Cre 小鼠与 Trp53fl/fl、KrasLSL-G12D/+、Nsun5fl/fl小鼠杂交，构建特异性敲除 Nsun5 肠型胃癌小鼠模型（NPK），并与未敲除的PK模型进行对比。
（2）转录组与表观转录组分析：
- RNA-seq：对NSUN5敲低或SW2-110A处理的细胞进行转录组测序，结合基因集富集分析（GSEA）鉴定下游信号通路。
- RNA-BS-seq：全转录组水平单碱基分辨率检测m5C修饰位点及其在NSUN5敲低后的动态变化。
- RT-qPCR & Western Blot：检测mRNA和蛋白表达水平。
- RNA稳定性分析：经放线菌素D处理后，检测CBX8 mRNA的半衰期。
- RNA免疫共沉淀（RIP）：验证NSUN5与CBX8 mRNA的直接结合。
- RNA Pull-down：验证YBX1蛋白与CBX8 mRNA结合依赖于NSUN5。
- 细胞功能实验：SRB法检测细胞增殖，Transwell实验检测细胞迁移能力。
- CUT&Tag-seq：全基因组水平分析SW2-110A处理对CBX8靶基因启动子组蛋白修饰（H3K27me3/H2AK119ub）和PRC1组分（RING1B）互作。
- 染色质免疫共沉淀（ChIP）：验证CBX8与 SOCS2 启动子互作，以及药物处理对Pol II结合的影响。
结果图形
（1）NSUN5促进肠型胃癌进展
研究发现，在TCGA数据库的胃癌患者中，NSUN5基因变化率在肠型胃癌中显著高于弥漫型胃癌，且与KRAS突变高度相关。为验证其功能，研究团队构建了Nsun5敲除的NPK小鼠模型。结果发现，与未敲除的PK小鼠相比，NPK小鼠在3月龄和6月龄时胃部肿瘤形成受显著抑制（图1C-D）。体外实验也证实在肠型胃癌细胞系中敲低NSUN5能显著抑制细胞迁移能力，提示NSUN5是KRAS突变肠型胃癌的一个关键驱动因子。
（2）NSUN5以m5C RNA甲基转移酶依赖方式显著调控JAK-STAT3信号
通过RNA-seq和GSEA分析，研究团队发现敲低NSUN5后，IL6-JAK-STAT3信号通路显著下调（图2A-B）。进一步实验证实，NSUN5敲低可以降低IL6诱导的STAT3磷酸化（p-STAT3）水平。野生型NSUN5可以恢复p-STAT3水平，而非催化活性缺失的突变体NSUN5C330A/C404A几乎完全丧失恢复能力（图2D），在小鼠肿瘤组织中也观察到类似现象（图2E-F）。表明NSUN5对JAK-STAT3信号调控完全依赖于其RNA甲基转移酶活性。
图2：NSUN5通过其m5C依赖性甲基转移酶功能调控JAK-STAT3信号通路
（3）NSUN5介导的m5C甲基化稳定CBX8 mRNA
为寻找NSUN5的直接靶点，研究团队进行了RNA-BS-seq，以单碱基分辨率鉴定NSUN5依赖性的m5C修饰位点。结果显示，NSUN5敲低后，m5C修饰在CDS区域的分布显著减少（图3B）。通过整合RNA-seq和RNA-BS-seq数据，发现CBX8是表达显著下调且CDS区m5C水平降低的关键基因。实验证实，NSUN5能结合CBX8 mRNA（图3G），并通过m5C修饰增加其稳定性（图3F）。进一步研究发现，m5C的reader蛋白YBX1能识别NSUN5介导的m5C修饰，并稳定CBX8 mRNA（图3I-J）。上述研究结果确立NSUN5→m5C修饰CBX8 mRNA→YBX1识别→CBX8 mRNA稳定的完整分子机制。
图3：CBX8被鉴定为GC中 NSUN5的m5C甲基化底物。
(C) RT-qPCR分析NSUN5敲低后BS-seq中8个候选基因的mRNA水平。
(D) TCGA数据库中NSUN5与候选基因表达的相关性分析。
(E) NSUN5与CBX8表达在TCGA STAD队列中的相关性分析。
(F) MKN28-shScramble和shNSUN5细胞系中CBX8 mRNA半衰期分析(n=4)。
(G) 在表达外源性Flag-NSUN5的MKN28-shNSUN5细胞中，RIP实验显示与Flag-NSUN5结合的CBX8 mRNA水平。
(H) 回补WT或突变型MKN28-shNSUN5细胞的m5C RIP实验琼脂糖凝胶图像(左)和CBX8 mRNA水平定量分析(右)。
(I) MKN28-shScramble和shNSUN5细胞RNA pul-down实验，随后WB分析YBX1蛋白水平。
（4）遗传和药理学抑制CBX8可抑制JAK-STAT3信号
研究团队鉴定出CBX8是NSUN5的下游关键靶点后，随后通过遗传（shRNA敲低）和药理学（CBX8抑制剂SW2-110A）两种手段抑制CBX8功能。结果发现，两者均能显著抑制STAT3磷酸化，并抑制胃癌细胞的迁移能力。RNA-seq分析显示，SW2-110A处理后的细胞转录组变化与NSUN5敲低后高度相似，尤其是IL6-JAK-STAT3通路均被显著抑制。表明CBX8是NSUN5调控JAK-STAT3信号的关键效应因子。
（5）SW2-110A抑制Nsun5介导的Trp53缺失/Kras突变胃癌细胞肿瘤形成
为验证体内药效，研究团队将构建好的小鼠胃癌细胞原位注射到小鼠胃壁。结果显示，敲除 Nsun5的NPK细胞成瘤能力显著弱于PK细胞，而重构野生型NSUN5能完全恢复其成瘤能力。此外，经SW2-110A处理携带NPK+WT肿瘤的小鼠，能显著抑制肿瘤生长，且小鼠体重无明显下降，表明该药物具有良好的耐受性和治疗效果。
（6）CBX8-PRC1抑制IL6-JAK-STAT3信号的负调控因子SOCS2
为阐明CBX8如何激活STAT3，研究团队发现CBX8能特异性结合SOCS2的启动子（图4A）。SOCS2是JAK-STAT3信号的负调控因子。CUT&Tag实验证实，CBX8与PRC1作用于SOCS2启动子，介导抑制性组蛋白修饰H2AK119ub1和H3K27me3的沉积（图4C）。抑制或敲低CBX8后，这些抑制性修饰减少，RNA聚合酶II（PolII）结合增加，从而解除对SOCS2的转录抑制，导致SOCS2表达上调（图4D），进而抑制JAK-STAT3信号通路（图4I）。
图4：CBX8与SOCS2启动子互作并抑制其转录
结论和启示
本研究通过RNA-BS-seq、RNA-seq等分析揭示了NSUN5通过m5C甲基化稳定CBX8 mRNA，CBX8进而通过PRC1复合体表观遗传沉默 SOCS2，从而激活JAK-STAT3信号通路，促进肠型胃癌的发生发展。靶向CBX8的小分子抑制剂SW2-110A能有效阻断这一通路，抑制肿瘤生长。
RNA-BS在本研究中的重要作用
RNA-BS技术精准绘制了NSUN5介导的m5C修饰图谱，并直接定位到其关键靶基因CBX8 mRNA上的具体修饰位点，为研究RNA甲基化修饰的生物学功能提供强有力技术支撑。RNA-BS-seq可以作为未来鉴定和验证RNA甲基转移酶底物、解析表观转录组调控网络的核心工具。
参考文献：
Yin J, Li L, Niu Y, Wang Q, Liu W, Gu Y, Wang X, Huang L. NSUN5-CBX8 m5C Axis promotes gastric tumorigenesis by activating JAK-STAT3 Signaling. Cell Signal. 2026 Apr 29:112563. doi: 10.1016/j.cellsig.2026.112563.
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