前言
利用 T 细胞杀伤肿瘤细胞能力的免疫疗法已经改变了临床肿瘤学的格局^[1]。通过引入单克隆抗体阻断 T 细胞上表达的免疫检查点分子程序性死亡蛋白 1（PD-1）与肿瘤细胞上表达的其配体 PD-L1之间的相互作用，临床治疗效果得到了最为显著的改善^[2]。利用合成嵌合抗原受体（CARs）或天然肿瘤特异性T细胞受体（TCRs）对 T 细胞进行工程改造，能够在体外生成具有肿瘤特异性的各种 T 细胞^[3]。为了筛选出最适用于临床的 T 细胞，并确定免疫检查点阻断是否能够增强杀伤效力，需要一个具有高通量能力和统计稳健性的体外筛选平台。
而 ibidi µ-Pattern 微图案（经 ibiTreat 组织培养表面处理）则提供了如此一个高通量筛选平台。其微结构表面创建了众多独立的反应腔室，可用于单个分析，从而能够在单个实验中进行多次重复，确保统计结果的可靠性。微区块应用广泛，尤其在评估免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤效力方面卓有成效。本实验方案阐述了一个使用微图案化表面进行肿瘤细胞-T 细胞杀伤实验的示例，以及相应的分析方法。

实验材料
1）细胞
RCC-26和 RCC-53细胞为贴壁生长的人肾细胞癌细胞系，由慕尼黑亥姆霍兹中心（Helmholtz Munich）从肿瘤组织中建立^[4]。
TCR53/CD8-T 细胞是通过逆转录病毒转导的人类原代T细胞，可表达抗原特异性、HLA-A2 限制性的 T 细胞受体TCR53，而该受体能识别特定的肿瘤细胞^[5]（亦即 RCC-26 及 RCC-53 细胞）。
2）培养基
RPMI 1640 培养基（Gibco，31870），并添加以下成分：

• 10% 胎牛血清（Anprotec，AN-S006G）
• 1% 青霉素/链霉（Pen/Strep）（Gibco，15140-122）
• 2 mM L-谷氨酰胺（Gibco，25030）
• 1 mM 非必需氨基酸（Gibco，11140-035）
• 1 mM 丙酮酸钠（Gibco，11360-039）
• 大鼠尾源胶原蛋白 I（ibidi，50201）

 
3）包被
大鼠尾源胶原蛋白 I（ibidi，50201）。
4）载玻片
ibidi μ-Pattern 微图案表面 8 孔高壁腔室载玻片（ibiTreat，cir200，pit600，hex）。
5）抗体

• 抗 PD-1 抗体（Biolegend，329926）
• 抗 PD-L1 抗体（Biolegend，329716）

 
6）其他

• 磷酸盐缓冲液（Gibco，14190-094）
• 0.01 M HCl（Merck，1.09057）

 
7）显微镜

• 明场显微镜（4× 物镜）
• 电动载物台
• ibidi 载物台培养箱，温度设为 37°C，二氧化碳浓度设为 5%

 
实验步骤
1）包被
为可视化 T 细胞的影响及其细胞杀伤效力，肿瘤细胞应保持活性并在 μ-Pattern 微区块上妥善贴壁，故需对实验所用之载玻片进行适当的包被处理。部分细胞亦可直接在 ibiTreat 表面上贴壁，但这可能会导致细胞行为发生变化，从而影响细胞杀伤过程。根据所使用的细胞类型，实验者可选择不同的包被条件（包括所用蛋白质、其浓度、包被时间以及洗涤步骤等）以实现最佳的细胞贴壁效果。最佳的包被条件应通过预实验确定。
针对本实验中使用的 RCC 细胞系，包被条件及步骤如下所示：

• 用 0.01M HCl 将胶原蛋白 I 稀释至 10 µg/mL；
• 在每载玻片腔室中各加入 150 µL 上述胶原蛋白 I 包被溶液；
• 将载玻片在 37°C 下孵育 1 h；
• 用 300 μL 无菌磷酸盐缓冲液洗涤各腔室 5 次。

 
2）接种肿瘤细胞
μ-Pattern 微图案上应覆盖适量的细胞——本实验之关键在于仔细确定细胞接种浓度以及培养条件，以在大多数μ-Pattern 微图案上形成肿瘤细胞单层并达到最佳的汇合度。实验者应注意避免细胞过于密集或相互堆叠生长——过高的细胞密度可能会影响细胞行为。理想的汇合度可以直接在接种后达到，亦可通过一定的增殖时间来实现。根据细胞大小，实验者有必要选择合适的 μ-Pattern 微图案尺寸。接种时所采用的细胞浓度、孵育时间、洗涤时间及步骤必须针对每种细胞类型进行调整。最佳的接种条件应通过预实验确定。
针对本实验中使用的 RCC 细胞系，接种条件及步骤如下所示：

• 将肿瘤细胞用培养基稀释至最佳接种浓度（经预实验确定）—— RCC 细胞体积较大，最佳接种浓度为 2.5×104cells/mL ；
• 在各个载玻片腔室中加入 300 μL 上述肿瘤细胞悬液；
• 在 37°C 培养箱中孵育肿瘤细胞 5 h，令其贴壁；
• 用 300 μL 无细胞培养基洗涤各载玻片腔室 3 次，以除去未贴壁细胞；
• 镜检肿瘤细胞在 μ-Pattern 微图案上的汇合度——对于 RCC-26 及 RCC-53 细胞，在接种浓度为 2.5×104cells/mL 、贴壁时间为 5 h，并在初始贴壁及洗涤步骤后，再 37°C 下培养 12~16 h，即可达到形成肿瘤细胞单层的最佳汇合度。

3）加入 T 细胞在肿瘤细胞生长至汇合后，加入 T 细胞开始进行细胞杀伤实验。建议实验者设置一个对照腔室，在该腔室中接种肿瘤细胞但不加入 T 细胞，实验者可观察该腔室以检测实验期间细胞的自发死亡或其他存活变化。在分析中包含对照可以准确描述 T 细胞介导的细胞杀伤效力。其他对照（如以不被所用之 T 细胞识别的肿瘤细胞作为对照）可能会提供有关 T 细胞杀伤行为的更多信息。

• 制备 T 细胞悬液——本实验采用以下 T 细胞悬液及对照试剂：

α） 2.5×104cells/mL T 细胞悬液；
β） 2.5×104cells/mL T 细胞悬液，加有 20 μg/mL 抗 PD-1 抗体及抗 PD-L1 抗体；
γ）不含 T 细胞的培养基（作为空白对照）。

• 将接种有肿瘤细胞的每个腔室中的培养基替换为 300 μL 上述 T 细胞悬液或对照试剂。

请注意！应迅速操作，以免细胞因干燥而失活。
4）镜检成像
根据细胞类型及杀伤率，实验者可能需要迅速开始成像以避免错过初始事件。为此，建议在加入 T 细胞之前预先选择需要成像的位置，并在必要时快速调整。根据所使用的细胞类型和细胞杀伤效力，实验持续时间和成像间隔可能会有所不同。

• 将载玻片放置在装有载物台培养箱（37°C，5% CO2）的显微镜（4× 物镜）上。
• 在每个载玻片腔室中选择至少 2×9 个镜检视野，每个镜检视野中因 µ-Pattern 微图案的尺寸及物镜放大倍率不同，所包含 μ-Pattern 微图案的数量亦有所不同（例如，在采用直径为 200 μm 的 μ-Pattern 微图案及 4× 物镜时，一个视野中将包含 4~5 个 μ-Pattern 微区块）；镜检视野应选在细胞汇合度接近 100% 且为细胞单层（即细胞未见堆叠式生长）的位置；
• 在前 3 h 内以较短的时间间隔（10 min）在明场下镜检成像；随后以较长的时间间隔（2 h）镜检成像直至实验结束（本实验中总镜检时长为 3 d）。

 5）结果与分析
T 细胞的杀伤效力通过在 T 细胞与肿瘤细胞共培养的 75 h 内测定每个时间点 μ-Pattern 微图案内肿瘤细胞的汇合度来评估。评估应在加入 T 细胞时肿瘤细胞已接近形成单层汇合的 μ-Pattern 微图案上进行。针对每种共培养条件，均对 9 个 μ-Pattern 微图案进行分析，并随时间推移进行追踪记录。示例图像如图 1 所示。 随后，如图 2 所示，于各时间点计算所选取的 9 个 μ-Pattern 微区块上肿瘤细胞汇合度平均值，并将其结果展示于 Y 轴，与 X 轴所对应的时间（单位：h）形成关联。

• 在早期时间点（00:40 h），所有 μ-Pattern 微图案上肿瘤细胞均显示完全汇合；
• 不含 T 细胞的空白对照（图 1 的第 1 行及第 3 行、图 2 中的橙色线）显示，随时间推移，肿瘤细胞汇合度没有降低，表明没有发生非 T 细胞依赖性的细胞死亡；
• 在 RCC-26 细胞与 TCR53/CD8 T 细胞的共培养体系中（图 1 的第 2 行，图 2 中的粉色线），肿瘤细胞汇合度迅速下降，07:40 h 时 μ-Pattern 微图案上肿瘤细胞覆盖率低于 50%，至 35:40 h 时 μ-Pattern 微图案上已无细胞；
• 在 RCC-53 细胞与 TCR53/CD8 T 细胞的共培养体系中（图 1 的第 4 行，图 2 中的绿色线），07:40 h 时 μ-Pattern 微图案上肿瘤细胞覆盖率仍为 100%，至 49:40 h 时降低幅度小于 50%；
• 当在 RCC-53 细胞与 TCR53/CD8 T 细胞的共培养体系中（图 1 的第 4 行，图 2 中的绿色线）中加入抗 PD-1 抗体及抗 PD-L1 抗体时，与未添加抗体的 TCR53/CD8-RCC-53 共培养体系相比，该共培养体系中肿瘤细胞汇合度下降得更快——这表明 PD-1/PD-L1 阻断作用增强了 T 细胞对 RCC-53细胞的杀伤效力，然而，该效力并未达到对 RCC-26 细胞的杀伤水平（图 1 的第 5 行，图 2 中的绿色虚线）。

 结果表明，TCR53/CD8 T 细胞对 RCC-26 肿瘤细胞的杀伤速度更快，效率也更高。添加抗 PD-1 抗体及抗 PD-L1 抗体提高了 TCR53/CD8 T 细胞对 RCC-53 肿瘤细胞的杀伤效力。

结论
研究发现，同一 T 细胞群体针对不同的肿瘤细胞系具有不同的杀伤效果。在此示例中，相同的 TCR53 转基因 T 细胞对 RCC-26 肿瘤细胞的杀伤效率远高于对 RCC-53 肿瘤细胞系的杀伤效率。本研究还进一步证实，通过添加检查点阻断抗体（如抗 PD-1/抗 PD-L1 抗体），可以增强 T 细胞的杀伤效力。
研究结果还表明，具有 μ-Pattern 微图案的 ibidi 多腔室载玻片作为一种高通量细胞实验平台，具有良好的操作性——多腔室设计允许在同一实验中研究不同的条件，即不同的肿瘤细胞系、不同的培养基添加剂或不同的 T 细胞；同时，由于 μ-Pattern 微图案阵列的存在，每种条件都包含多个微区块重复样本，以便进行个体数据收集，从而支持统计分析。

参考：
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2. Sharma, P., S. Goswami, D. Raychaudhuri, B. A. Siddiqui, P. Singh, A. Nagarajan, J. Liu, S. K. Subudhi, C. Poon, K. L. Gant, S. M. Herbrich, S. Anandhan, S. Islam, M. Amit, G. Anandappa, and J. P. Allison. 2023. 'Immune checkpoint therapy-current perspectives and future directions', Cell, 186: 1652-69.
3. Zhao, L., and Y. J. Cao. 2019. 'Engineered T Cell Therapy for Cancer in the Clinic', Front Immunol, 10: 2250.
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