PLC（磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C）是细胞膜关键信号水解酶，分6大亚型，目前临床管线最多、商业化潜力最大的是PLCγ1 和PLCγ2；PLCγ1 选择性抑制剂主要涉及实体瘤、血管肉瘤、纤维化，PLCγ2 选择性抑制剂主要涉及血液瘤和自身免疫双适应症。直接靶向 PLCγ1全部处于基础研究 / 临床前阶段，无进入人体临床一期的选择性候选药物，间接作用于PLCγ1的上市药物有如下：

PLC-γ1信号的简化通路

PLC-γ1是一种胞质酪氨酸激酶，在受体或非受体酪氨酸激酶的信号传导中起着关键作用。

在T细胞受到刺激时，Src家族蛋白磷酸化T细胞抗原受体（TCR）上的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）。磷酸化的ITAMs招募ZAP-70和SLP-76，这些分子结合PLC-γ1，通过磷酸化激活其Tyr783催化域。或者，受体酪氨酸激酶的激活通过结合PLC-γ1的N端SH2结构域，诱导PLC-γ1在Tyr 783发生磷酸化。

以EGFR单克隆抗体为例，基于细胞的功能验证主要围绕以下核心机制展开:

通过特异性结合并封闭EGFR受体，阻断受体介导的信号传导通路，最终发挥抗肿瘤效应。为验证这一功能性改变，需通过多层次的生物标志物进行综合评估，包括下游衔接体(如GRB2)、激酶(如PLC-γ)、第二信使(如IP1)、转录因子(如NF-kB)及细胞因子等关键指标。

在基于细胞的功能验证体系构建中，HTRF及Alpha检测技术已形成覆盖激酶、第二信使、信号通路及细胞因子四大检测维度的完整解决方案，其科学性与可靠性获得全球医药巨头的广泛认可。

1PLC-γ1(tyr783)原理

HTRF试剂盒可以实现基于细胞的定量检测，检测PLC-γ1(tyr783)原理如下：

该检测完全基于微孔板，无需洗板。该检测使用两种抗体的基于夹心结构检测PLCγ1(Tyr783)，一个供体抗体含有Eu3+荧光团标记，另一个受体抗体有d2标记，使供体荧光团靠近受体，从而产生FRET信号。其强度与样品中磷酸化蛋白的浓度成正比，提供了在无需洗涤，即可测定磷酸化状态（我们也提供Total蛋白的检测试剂盒）。

基于AlphaLISA技术的检测原理和数据：

2PLC-γ1（Tyr783）测定流程：

双板方案在裂解前先在96孔板培养细胞，然后将裂解物转移到384浅孔板中，再加入PLC-γ1（Tyr783）HTRF检测试剂。

单板测定利用HTRF试剂检测磷酸化PLC-γ1（Tyr783）可以在一块用于培养、刺激和裂解的单板中完成，无需洗涤步骤。

案例分享

EGF刺激的A431细胞检测活化的PLC-γ1磷酸化：

人A431细胞在96孔种板，每孔5 x 104个细胞，50 µL培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下过夜后，加入50µL梯度稀释的EGF刺激5分钟，裂解液处理30分钟后，使用双板测定方案测量了磷酸化和总PLC-γ1，结果如下图。

3其他HTRF技术原理

除此之外我们还可以检测上游ITK水平，基于HTRF技术原理如下：

可用于检测细胞水平上ITK水平变化，检测流程如下所示，以悬浮细胞为例：

案例分享

我们使用悬浮细胞JURKAT细胞(每孔4 x 105个细胞)的结果如下，细胞被不同浓度的ITK靶向的PROTAC(BSJ-05-037)处理4小时。对照组细胞先被预先处理2小时，用1 M的Epoxomicin(蛋白酶体抑制剂)处理，随后再用不同浓度的ITK靶向的PROTAC(BSJ-05-037)处理4小时。然后，细胞被用裂解缓冲液室温处理30分钟，裂解后，将16L裂解物转移至微孔板中检测总的ITK水平。

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