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LCI用于定量与多色超分辨显微成像的荧光团开关电化学调控

2026-08-12     来源:本站     点击次数:70

产品  : Chamlide EC — 载物台式电化学成像样品池,集成ITO工作电极盖玻片与三电极体系(参考型号:EC 22)。

研究团队 : 杨英 教授,荧光调制与成像实验室,北京航空航天大学物理学院,北京 — 该研究方向始于新南威尔士大学(UNSW)化学学院 Gooding 课题组。

范围  : 2024–2026年发表的六篇同行评议论文:Nature Photonics(2篇)、PNAS、Angewandte Chemie、Chemical Science、Accounts of Chemical Research。

内容概要

●    传统STORM依赖激光驱动的随机闪烁。这一过程难以控制,约三分之一的染料会被不可逆光漂白,单幅图像有时需要数十分钟。
●    将盖玻片本身做成电极后,施加电位即可按需开启和关闭荧光团,使闪烁从随机现象变为可控的实验变量。
●    荧光团回收率约100%(传统方法约65%)、41 nm分辨率、6秒达到80 nm(比STORM快约75倍),并可在不改动硬件的前提下在单一光学通道内分离四种染料
●   ​ 以下全部结果均在 Chamlide EC 样品池中获得。该产品最初源于本课题组的定制需求,目前已在相关论文中被以产品名直接引用。


闪烁带来的问题
单分子定位显微镜(SMLM)以一个简单的思路突破衍射极限:若在任一瞬间只有极少量荧光团发光,就能以数十纳米的精度确定每个孤立分子的位置,再将数千帧图像合成为一幅超分辨图像。因此一切都取决于闪烁。传统上,这种闪烁依靠高功率激光和化学开关缓冲液诱导产生,而三个实际问题也由此而来。

●    无法控制。 开关过程是随机的。实验者只能等待分子闪烁,而不能决定其发生时刻,且闪烁速率在视野内各处存在差异。
●    分子会丢失。 强照明会使大部分染料发生不可逆光漂白。若约三分之一的标记无法恢复,就无法统计结构内的分子数量,图像只能停留在定性层面。
●    速度慢。 在大视野下积累足够的定位数据可能需要数十分钟,限制了通量,也无法用于动态过程。

该领域反复回到的问题是:能否由实验者设定的外部条件直接驱动开关过程,而不是把它交给光化学。

另一条思路:用电位实现开关
杨英 教授团队给出的答案是电化学。许多荧光团具有氧化还原活性:还原后转变为无荧光的“隐色体(leuco)”形式,氧化后荧光即恢复。若样品置于电极之上,施加的电位便可作为染料的开关——可逆,且时机由实验者决定。

要实现这一点,需要一个既是电极又是光学窗口的部件。镀有氧化铟锡(ITO)的盖玻片正好满足:导电性足以作为工作电极,透明度足以让物镜直接透过观察,平整度足以让细胞直接在其表面培养或固定。

图1 — 电化学成像平台。(a)ChamLide EC 样品池中的三电极体系:ITO镀膜盖玻片同时作为工作电极与成像基底,上方缓冲液中设有铂对电极与Ag/AgCl参比电极,TIRF激发光经玻璃入射。(b)ATTO 647 的相关化学过程:两电子、两质子还原使荧光染料转变为无荧光的隐色体,该反应可逆。(c)扫描电位时测得的荧光:电位向负方向变化时发光降至接近零,回扫时恢复;下方帧序列显示单个分子的熄灭与再点亮。来源:Hagness et al., Chem. Sci. 2025;16(20):8959–8969 — 开放获取,CC BY 4.0。

样品池必须满足的条件

将电化学与单分子成像结合,对样品池提出了普通成像皿无法满足、普通电化学池同样无法满足的要求。

●    导电且透明的底面。 ITO盖玻片必须同时充当电极与光学面。
●    为高NA物镜留出工作空间。 超分辨需要工作距离极短的油镜,因此样品下方必须足够薄——这与典型的大体积电化学池要求正好相反。
●    可重复的三电极几何布局。 对电极与参比电极每次都须处于相同位置,否则施加的电位在不同实验之间不可比较。
●    密闭的小体积腔室。 开关缓冲液对氧敏感并含氧化还原介质,蒸发或空气进入都会改变开关行为。
●   ​ 与标准倒置显微镜兼容。 整套装置须能安装在常规载物台上,并在不加装定制光学元件的情况下适用于TIRF与共聚焦光路。

Chamlide EC 将上述条件集成于一个载物台式装置中。如下列论文的实验方法所述,实验使用“Chamlide EC 22(Live Cell Instrument)”样品池,在含半胱胺、铁氰化物等氧化还原介质的低氧缓冲液中由恒电位仪提供电位。值得注意的是,该样品池最初源自本研究方向的定制需求,此后成为相关论文中被以产品名引用的平台。

六篇论文的研究成果

年份 方法 主要报道结果 期刊
2024 EC-STORM 荧光团回收率约100%(传统方法约65%);分辨率约41 nm 对约53 nm;在DNA纳米标尺上实现精确分子计数 Nature Photonics
2025 EC-SOFI 约6秒达到约80 nm分辨率;大视野下比STORM快约75倍;相比紫外激活,开关速度提高3倍、空间不均一性降低一半 PNAS
2025 EC 多色 在单一光学通道内分离4种光谱重叠染料;三通道共6色;串扰 r < 0.02;用单色光路实现4色STED Nature Photonics
2025 染料筛选 跨8个化学类别表征12种荧光团;阐明缓冲液与氧气对开关行为的影响 Chemical Science
2026 光谱分离与3D 将电化学开关拓展至光谱分离与三维STORM Angew. Chem. Int. Ed.
2026 领域综述 系统梳理从强度调制到单分子开关的领域综述 Acc. Chem. Res.
表1 — 电化学荧光成像研究计划的代表性成果。所有研究均在 ChamLide EC 样品池中完成。

分辨率与完整性的直接对比

最直观的证据来自同一样品的直接对比。研究者对COS-7细胞中免疫染色的微管分别用传统方法和电化学调控方法成像,并通过强度线剖面与傅里叶环相关(FRC)两种方式评估。FRC是SMLM中衡量分辨率的标准客观指标。

图2 — 传统STORM与EC-STORM的对比。(a)COS-7细胞微管分别由传统STORM(I、III)与EC-STORM(II、IV)重建,下排为方框区域的放大图。在传统图像中相互融合的纤维,在电化学调控下被分辨为独立的细丝。(b)沿标记线的强度剖面:EC-STORM(红色实线)峰形更深、分离清晰,而传统方法(蓝色虚线)将相邻纤维模糊为一个宽峰。(c)傅里叶环相关:EC-STORM曲线在更高的空间频率处越过阈值,对应更精细的分辨率——约41 nm 对约53 nm。来源:Yang et al., Nature Photonics 2024;18(7):713–720,经作者许可转载。

这一提升有明确的物理原因。将电位保持在合适数值可降低同时发光的分子密度,从而减少定位重叠,使每个分子的拟合更加准确。随后反向施加电位,几乎全部染料都会回到荧光态,而不是有三分之一保持漂白状态。正是这一点使得分子计数成为可能,而不仅仅是可视化。

典型实验条件

项目 参考论文中使用的条件
工作电极 ITO镀膜玻璃盖玻片 — 同时作为成像基底
对电极 / 参比电极 铂丝 / Ag/AgCl
样品池 ChamLide EC 22(Live Cell Instrument),载物台式三电极
施加电位 相对Ag/AgCl约 −0.8 V 至 +0.15 V,由恒电位仪设定或扫描
缓冲液 含氧化还原介质(如半胱胺、铁氰化物)的低氧成像缓冲液
荧光团 Alexa 647、ATTO 647(STORM/SOFI);Alexa 488/555/568/594、ATTO 655、STAR RED/635、SiR、EGFP、mCherry(多色)
样品 固定并免疫染色的COS-7、HeLa、U-2 OS细胞;DNA折纸纳米标尺
适用技术 STORM、SOFI、STED、光谱分离、3D STORM
表2 — 根据参考论文实验方法整理的条件,可作为实验室引入该技术的起点。最佳参数因染料和样品而异。

不止于超分辨

同一样品池也支持与SMLM无关的研究,因为它本质上提供的是以单分子灵敏度对电极表面进行光学观察的能力。

●    单分子光谱电化学 — 以单个分子为单位观察氧化还原事件,而非仅记录系综电流。
●    染料与探针表征 — Chemical Science 的研究筛选了香豆素、罗丹明、氧杂蒽、吖啶、碳吡咯烷、碳罗丹明、菁类与噁嗪等类别中的12种荧光团,为判断哪些探针可响应电位调控提供了参考。
●    ​电化学生物传感的光学读出 — 在同一表面上结合电化学触发与荧光检测。 

“ChamLide 电化学样品池已成为我们实验平台的重要组成部分,使我们能够将可靠的电化学调控与先进的荧光及超分辨成像结合起来。”

— 杨英 教授,课题组负责人(PI),荧光调制与成像实验室,北京航空航天大学物理学院

对您的成像实验意味着什么

●    开关成为可控变量 — 施加电位可在您选定的时刻开启和关闭荧光团,获得比仅用光照更快、更均匀、更完整的闪烁。
●    从定性走向定量 — 近乎完全的荧光团回收使分子计数成为可能,独立的FRC分析亦印证了分辨率的提升。
●    用现有光学系统获得更多颜色 — 电化学“指纹”可增加单色光路的通道数,无需新增滤光片或激光器。
●    一个样品池兼顾两个领域 — ITO工作电极盖玻片与一体化三电极体系,把光谱电化学带到标准倒置显微镜上。我们也提供定制配置——这条产品线本身正是从一次定制需求开始的。

参考文献与图片来源

Yang Y, Berengut JF, Lee LK, Tilley RD, Kaus G, Gooding JJ. Electrochemically controlled blinking of fluorophores for quantitative STORM imaging. Nature Photonics. 2024;18(7):713–720.
Yang Y, Ma Y, Tilley RD, Gooding JJ. Electrochemically controlled switching of dyes for enhanced superresolution optical fluctuation imaging (EC-SOFI). PNAS. 2025;122(28):e2425390122.
Yang Y, Ma Y, Macmillan A, Tilley RD, Gooding JJ. Electrochemical fluorescence modulation enables simultaneous multicolour imaging. Nature Photonics. 2025;19(7):718–724.
Yang Y, Ma Y, Gooding JJ. Electrochemical dye switching assisted spectral demixing and 3D STORM imaging. Angewandte Chemie Int. Ed. 2026;65(18):e17001.
Hagness DE, Yang Y, Ma Y, Ishtiaq S, Fan S, Tilley RD, Gooding JJ. An investigative study of electrochemical induced fluorescence for fluorophores. Chemical Science. 2025;16(20):8959–8969.
Yang Y, Ma Y, Tilley RD, Gooding JJ. Electrochemical control of fluorescence emission: from intensity modulation to single molecule switching for applications in light microscopy. Accounts of Chemical Research. 2026;59(5):751–761.
图1引自 Hagness et al., Chemical Science 2025,© 原作者,依据 CC BY 4.0 许可(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)使用;除按版面调整尺寸外未作其他修改。图2引自 Yang et al., Nature Photonics 2024,经作者许可转载。

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