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siRNA与各类shRNA技术差异、适用细胞及实验场景整理

2026-08-21     来源:本站     点击次数:137

Section.01
真不能盲选 siRNA 吗？

结论先行：
siRNA 是体外短期敲低的有效手段，但无法一劳永逸。
RNAi：从先天防御到工具化
RNA 干扰 (RNAi) 是天然存在的细胞机制，最初用于抵御外来病毒入侵。

病毒入侵并复制时，会产生独特的双链 RNA (dsRNA) 中间产物，dsRNA 被宿主细胞内的 Dicer 酶切割成小干扰 RNA (siRNA)，这些 siRNA 被整合到 RNA 诱导的沉默复合物 (RISC) 复合物中，其中两条链相互分离。含有引导链或反义链的 RISC 会寻找并结合互补的病毒信使 RNA (mRNA)。随后，RISC 中的 Argonaute 酶 (负责降解 mRNA 的酶) 将这些 mRNA 序列切割降解，导致 mRNA 表达下调，从而使病毒无法利用细胞工厂合成自身蛋白而失活 (图 1)。

图片图 1. RNA 干扰的细胞机制[1]。

1998 年，科学家 Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello 在研究线虫时发现，只需人为向细胞内注射一小段人工合成的双链 RNA (dsRNA)，就能主动诱发该机制。这段 dsRNA 的序列只要与目标基因的 mRNA 互补，就能精准指挥细胞内的切割机器（Dicer 和 RISC 复合体）去定点清除该 mRNA。该发现也荣获 2006 年诺贝尔奖[2]。

但早期尝试发现哺乳动物细胞对长链 dsRNA 会引发细胞强烈的抗病毒干扰素反应。直至 2001 年，科研团队发现：如果直接向哺乳动物细胞输入已经修剪好的、只有 21-23 个碱基对的siRNA，就能绕过细胞的免疫警报，成功实现单基因的精准敲低。由此开启了 RNAi 的广泛应用时代[3]。

作为一种高效的基因敲低工具，siRNA 拥有诸多优点：
特异性高
通过碱基互补配对，能够精准锁定并降解目标 mRNA，极少误伤其他基因。
起效快

化学合成的 siRNA 转染进细胞后直接起效 (24-48h 达峰值)，作用时间一般维持数天到一周，随着细胞代谢自然消失，非常适合短期功能验证实验。

效率高
极低浓度（纳摩尔级别）就能显著抑制目标基因的表达（80% 以上）。
设计周期短
只需知道靶基因序列，几天内就能合成出有效的 siRNA。
操作门槛低
常规的脂质体转染就能轻松送入细胞，对绝大多数细胞系都适用。

如今，科研人员可以直接在电脑上设计针对任何已知基因的 siRNA 序列，然后通过化学合成定制试剂，直接用转染试剂（如脂质体）包裹送入细胞。siRNA 设计和转染详见往期：如何做 RNA 干扰实验？(常见问题+解决方案)
 
图片图 2. siRNA 作用实验流程示意图。
  
『siRNA 适用场景』
 
siRNA 最适合用于易于转染、分裂活跃、需要快速验证基因短期功能的实验场景。

一、【适合的细胞系特点】

  • 高转染效率细胞：如 HEK293、HeLa、A549、NIH3T3 等常规外源 DNA/RNA 极易进入的细胞。
  • 分裂活跃的细胞：细胞分裂能加快转染试剂的摄取，利于 siRNA 快速在细胞质中均匀分布。
  • 贴壁细胞：相比于悬浮细胞，贴壁细胞更容易通过常规脂质体转染实现 80% 以上的敲低效率。

 
二、【适合的实验场景】

  • 短期功能研究：实验周期在 24 到 96 小时内 (如短期细胞增殖、凋亡、迁移或瞬时信号通路激活实验)。
  • 常规高表达基因：目标 mRNA 表达量正常或偏高，siRNA 可以通过高效降解实现立竿见影的"敲低"效果。
  • 高通量靶点筛选：需要同时验证几十甚至上百个候选基因，siRNA 合成快、成本低、转染自动化程度高。
  • 致死性基因研究：某些基因完全敲除会导致细胞死亡，而 siRNA 适度降低表达量可以维持细胞存活以供观察。

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『哪些情况不适用 siRNA？』
  • 原代细胞与悬浮细胞：如 T 细胞、B 细胞、原代神经元，这类细胞极难转染，通常需要借助慢病毒。
  • 长期观察实验：siRNA 沉默效果通常仅维持 3~7 天，实验需要持续数周或数月 (如长期稳转株筛选、动物体内长期观察)，这时更适合用 shRNA 或 CRISPR-Cas9。
  • 丰度极高或半衰期极长的蛋白：如果目标蛋白本身非常稳定、不易降解，即使 mRNA 被 siRNA 破坏，原有的蛋白也需要很久才能消耗完，导致短期内看不到敲低效果。
 
总之，siRNA 是不能盲选的！一旦选错，可能真的撑不起你后续的实验需求。

Section.02
质粒、慢病毒、AAV

这 3 种 shRNA 到底"差"在哪？

如果想实现长期基因抑制，就要关注下 shRNA 了！科学家将 RNAi 序列设计为短发卡结构，即 shRNA。将 shRNA 连入病毒或质粒载体导入细胞后，细胞可持续转录 shRNA，实现基因沉默。

shRNA：构建稳转株

与 siRNA 不同，shRNA 可以游离形式存在，载体类型为质粒或腺相关病毒 (AAV) ，腺病毒（图 3A），也可通过慢病毒 (Lentivirus) 转染整合到基因组（图 3B），最终都汇聚于 RISC 复合物。

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图片图 3. shRNA 机制示意图[4]。

(A) 以质粒为例，质粒 DNA 缺乏“整合酶”和特定的病毒整合序列。质粒进入细胞核后，是作为游离体 (Episome) 游离在染色体之外。它依靠自身的启动子 (如 U6) 转录产生 shRNA。(B) 通过慢病毒 (Lentivirus) 转染整合到基因组：转录后，该产物模拟pri-microRNA，并经 Drosha 加工形成 pre-shRNA，pre-shRNA 随后由 Exportin 5 从细胞核输出。之后，pre-shRNA 经 Dicer 加工并与 RISC 复合物结合。乘客链被降解，反义引导链则引导 RISC 降解互补靶 mRNA。

当然，shRNA 转导载体不同，它们的适用范围也天差地别。

1. 质粒-shRNA (游离体，不整合)

  • 递送方式：普通转染试剂 (脂质体/电转)。
  • 在细胞内的命运：进入细胞核后，游离在染色体外 (Episome) ，不整合到基因组。
  • 核心差异 (差在哪)：
  • 优点：构建最快、成本极低 (合成寡核苷酸仅需几百元)；可轻易与其他质粒 (如 GFP 标签) 共转染。
  • 致命伤：随细胞分裂而逐渐丢失 (除非用抗生素持续加压，但加压本身会改变细胞状态)；且转染效率受限于细胞类型。
  • 真实用途：过渡性工具。常用于低成本海选 shRNA 靶点 (为后续慢病毒做准备)，或进行瞬时共转染的拯救实验。

 
2. AAV-shRNA (游离体，但极稳定)

  • 递送方式：病毒注射 (局部或全身)。
  • 在细胞内的命运：进入非分裂细胞 (如神经元、心肌、肝细胞) 后，主要以游离体形式长期稳定存在，极少整合。
  • 核心差异 (差在哪)：
  • 优点：免疫原性极低、扩散性好、安全性极高 (临床级载体)。在终末分化的不分裂细胞中，游离体不会因分裂丢失，可维持数年。
  • 局限：装载容量有限 (<4.7kb)；制备纯化门槛高，生产成本昂贵。
 
真实用途：动物体内 (In vivo) 的特异性器官敲低。特别是脑立体定位注射 (配合水迷宫行为学) 和心脏/肝脏靶向干预。

3. 慢病毒-shRNA (基因组整合，继承)

  • 递送方式：病毒感染 (转导)。
  • 在细胞内的命运：病毒携带的 shRNA 表达框通过整合酶插入宿主基因组 DNA。
  • 核心差异 (差在哪)：
  • 优点：一旦整合，子代细胞表达 shRNA，彻底解决“稀释效应”；能高效攻克质粒转染不进的悬浮细胞、原代细胞。
  • 代价：制备周期长 (1~2 周)、生物安全等级要求高 (BSL-2)，且随机插入存在致突变风险。
  • 真实用途：长期稳转株的底牌。用于裸鼠皮下成瘤、尾静脉转移模型，以及任何超过 1 周的细胞功能实验。

 
Section.03
siRNA，质粒、AAV、慢病毒，
各类实验到底怎么选？

在分子生物学和细胞生物学研究中，选择以上哪种 RNAi 工具主要取决于：(1) 目标细胞的类型：易转染细胞、难转染细胞或原代细胞？(2) 实验周期：短期瞬时敲低、长期稳定敲低？(3) 是在体外还是体内进行实验？
 
以下整理了详细文献案例，可查找匹配自身实验需求的内容！

一、 选择 siRNA 转染的实验

  • 核心特点：化学合成的小片段，通过脂质体等转染试剂直接进入胞质发挥作用。起效极快 (24-48h)，但维持时间短 (一般 3-7 天)。适用于易转染的肿瘤细胞系 (如 HeLa, MDA-MB-231, A549 等) 中开展的短期表型观察。
『RT-qPCR』
 
在转染后 24-48 小时检测目标基因 mRNA 的瞬时敲低效率，或相关基因的表达水平。
 
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『Western Blot』
 
在转染后 48-72 小时检测目标蛋白水平的表达下降，或相关蛋白水平的表达。
 
注：mRNA 降低≠蛋白一定降低，WB 通常最直观，可与 RT-qPCR 结果相互佐证。
 
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『ELISA』
 
酶联免疫吸附试验 ，是专门针对可溶性分泌蛋白 (如外泌的细胞因子、趋化因子、生长因子) 的绝对定量实验。
 
图片图 6. NMRAL1 siRNA 转染对 RAW264.7 巨噬细胞中炎症细胞因子表达的影响。空白对照组 (NC)、LPS处理的模型组 (Mod) 和模型+转染组 (Mod+Trans)[8]。
 
『免疫荧光 (IF)』
 
用于细胞原位检测蛋白质表达，可检测蛋白总量变化，提供蛋白亚细胞空间定位信息。
 
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图 7. 通过细胞荧光分析显示，si-BMAL 转染的 NP 细胞和 TNF-α 处理的 NP 细胞均出现收缩。(比例尺：左图 100 µm，右图 20 µm)[7]。
 
『细胞活性/增殖』
 
如 CCK-8 / MTT / EdU/台盼蓝染色等，检测基因沉默后，细胞的增殖能力是加快还是减慢。
 
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『流式细胞术』
 
流式细胞术分析 (Flow Cytometry)：转染 48 h 左右，通过 Annexin V/PI 双染检测细胞凋亡率，或通过 PI 单染检测细胞周期阻滞。
 
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图 9. 流式细胞术分析显示，Si-BMAL1 和 TNF-α 处理后 Annexin-V 阳性细胞比例上调[7]。
 
『Transwell / 划痕』
 
常用于肿瘤研究，检测基因敲低后细胞的迁移与侵袭能力变化。
 
图片图 10. POLD2 抑制显著降低了 A172 细胞的 Transwell 侵袭能力[11]。
 
『荧光素酶报告基因检测』
 
荧光素酶报告基因检测 (Luciferase Assay)：验证转录因子被 siRNA 敲低后，其目标启动子或增强子的转录活性是否受到抑制。
 
图片图 11. 双荧光素酶报告基因检测表明，ZNF488 促进了 SCD1 启动子的转录活性[10]。

二、选择慢病毒-shRNA转导的实验

  • 核心特点：慢病毒能将 shRNA 表达框整合到宿主细胞的基因组中，随细胞分裂而复制。适用于难转染的细胞 (如原代细胞、悬浮细胞如 THP-1、T 细胞等) 以及需要长周期、甚至建立稳定细胞株的体外和体内实验。
 
『悬浮细胞/原代细胞』
 
悬浮细胞或原代细胞的表型实验，如 CCK-8、流式凋亡、Transwell 。这些细胞对脂质体毒性敏感且质粒转染率极低 (通常 <10%) ，必须用慢病毒进行高效转导。
 
图片图 12. 与正常神经元细胞 (a) 相比，OGD/R 处理在 24 小时诱导神经元细胞凋亡 (b) 。shRNA-Gadd45b 处理增加了凋亡细胞的数量 (c) 。shRNA-Huwe1 处理减少了凋亡细胞的数量 (d) [12]。
 
『平板克隆形成实验』
 
平板克隆形成实验 (Colony Formation Assay)：该实验通常需要培养 7-14 天。siRNA 的效力在 7 天后基本消失，因此需要转染 shRNA 质粒，利用抗生素维持压力，观察单细胞的长周期克隆增殖能力。
 
图片图 13. 将表达 shRNA-POLD2 或 shRNA-对照的 A172 细胞接种于培养板 (500 个细胞/孔) 中，培养 12 天。计数≥50 个细胞的克隆，以评估克隆形成能力[11]。
 
『长周期悬浮球培养』
 
长周期悬浮球培养实验 (3D Tumor Spheroid/Organoid Culture)：肿瘤细胞成球或类器官培养往往需要 2 周以上，须使用慢病毒构建的稳转细胞来进行。
 
图片图 14. 将 GBM1A 球体用表达 shRNA-POLD2 或 shRNA-对照的慢病毒转导。将等量的活细胞培养 10 天，并通过计算机辅助图像分析定量球体数量。GBM1A: GBM 来源的神经球细胞系[11]。
 
『皮下成瘤』
 
裸鼠皮下成瘤实验 (In vivo Xenograft Tumor Model)：将体外构建好的稳转细胞系注射到裸鼠皮下，观察 3-6 周内体内肿瘤的生长体积、重量曲线。
 
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图片图 15. 将 NC 和 siRNA-3 序列构建到慢病毒载体中，命名为 pLKO.1 和 pLKO.1-sh3。将 HCT116-pLKO.1 或 HCT116-pLKO.1-sh3 细胞皮下移植到 5 周龄 BALB/c 裸鼠 (每组 5 只) 。HCT116-pLKO.1-sh3 组皮下肿瘤的生长速度显著低于 HCT116-pLKO.1 组 (B) ，HCT116-pLKO.1-sh3 组的肿瘤重量显著低于 HCT116-pLKO.1 组 (C) [13]。
 
『肿瘤转移』
 
裸鼠尾静脉肿瘤转移实验 (In vivo Tumor Metastasis Model)：将携带荧光素酶 (Luciferase) 和 shRNA 的稳转细胞通过尾静脉注射入裸鼠体内，长期通过小动物活体成像技术观察体内肝脏转移或骨转移病灶。
 
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三、 选择 AAV-shRNA 转导的实验

  • 核心特点：AAV 免疫原性极低、扩散性好、安全性高，可在非分裂期细胞 (如神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞) 中能介导长达数月乃至数年的长期稳定表达。因具备上述优势，AAV-shRNA 广泛应用于神经系统相关基因功能研究。
 
『脑立体定位』
 
脑立体定位注射实验 (Stereotaxic Brain Injection)：在小鼠特定脑区 (如海马区、皮层) 立体定位注射 AAV-shRNA，敲低特定基因，用于后续的 Morris 水迷宫实验 (行为学检测)、旷场实验 (Open Field Test) 等神经科学研究。
 
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四、 选择质粒-shRNA 转染的实验 (不常用)

  • 核心特点：属于质粒 DNA 分子，通常需要进入细胞核进行转录。起效慢于 siRNA，但持续时间比 siRNA 略长。如果带有抗生素筛选标记 (如 Puromycin) ，可通过药物筛选获得短期稳定表达的细胞群体。同样适用于易转染的细胞系。

 
适用场景

  • 场景一：需要筛选多条序列 (低成本海选，哪个敲低效率高)

针对一个基因，你通常要设计 3-5 条 shRNA。合成 5 条 siRNA 可能要花 3000-5000 元，且只有一次实验机会。而合成 5 对 shRNA 寡核苷酸仅需几百元，连接转化后可以无限制备质粒，可以反复转染验证，性价比极高。
 

  • 场景二：测靶点有效性 (为后续慢病毒制备稳转株做准备)
质粒是实验室常用的过渡工具。科研人员进行成本较高的慢病毒包装前，通常会先购买低价质粒瞬时转染细胞，在 48 小时内检测 shRNA 能否有效敲低目标基因，验证靶点有效性。若质粒转染无法敲低，则说明 shRNA 序列设计失败，可避免浪费资金进行慢病毒包装。
 
此外，若打算用慢病毒构建敲低稳转株，须在质粒阶段验证 shRNA 序列；此时若使用 siRNA，因二者序列设计原理不同，验证结果无法适用于病毒体系。
 
  • 场景三：需要与其他质粒共转染 (做拯救实验)
shRNA 敲低基因存在脱靶效应 (Off-target effect) ，也就是说，你的 shRNA 可能不仅干掉了目标基因 A，还意外顺手干掉了基因 B。如果此时细胞死了，你无法确定是因为失去了 A，还是因为失去了 B。
 
因此，基因功能研究中，通常在敲低内源基因的同时，转染一个带 GFP 标签的外源抗性基因 (mRNA 突变体) 来做“拯救”实验。质粒 shRNA 可以和这个标签质粒一起共转染，同时进入细胞。siRNA 是 RNA，无法与 DNA 质粒长期共存，且容易互相干扰转染效率。
 
小结
  • 体外 + 短期 (<7天)+ 易转染 = siRNA (日常选用)
  • 体外 + 中期 + 需共转染/预筛选 = 质粒-shRNA (过渡跳板)
  • 体外 + 长期 (>7天)+ 难转染/稳转株 = 慢病毒-shRNA (底牌)
  • 体内 + 组织特异性 + 非分裂细胞 = AAV-shRNA (黄金标准)

 
✨ 记住：不是越贵越好，也不是越简单越好，而是“匹配实验生命周期”的才是好的。 搞清楚你的细胞分裂速度和实验终点时间，选型错误率直接降低 80%。

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参考文献：
[1] Bumcrot D, et al. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nat Chem Biol. 2006 Dec;2(12):711-9.
[2] The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach 2026. Mon. 3 Aug 2026.
[3] Elbashir SM, et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.
[4] Aguiar S, et al. RNAi mechanisms in Huntington's disease therapy: siRNA versus shRNA. Transl Neurodegener. 2017 Nov 27;6:30.
[5] Amini R, et al. Combination Therapy with PIK3R3-siRNA and EGFR-TKI Erlotinib Synergistically Suppresses Glioblastoma Cell Growth In Vitro. Asian Pac J Cancer Prev. 2021 Dec 1;22(12):3993-4000.
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