原文摘自 Jason Hupp 与 Richard Vath 合著的 A Hitchhiker's Guide to Leaf-Level Gas Exchange 第 11 章第 3 节。

光合作用过程中，CO₂ 同位素组成的变化及其对不同同位素形式的选择性（即“同位素分馏”）构成了一种实时响应信号。该信号由大气至叶绿体 CO₂ 库之间一系列扩散过程与酶促反应共同调控，其中叶肉导度（gₘ）在该过程中发挥了重要调节作用。

通过在线碳同位素分馏判别测量，可在与气体交换实验相同的系统中，直接检测 CO₂ 同位素构形体分子（isotopologues），从而实现对叶肉导度的测量。

与传统脉冲调制式PAM 荧光–气体交换耦合方法相比，该方法不依赖于基于光合作用限制因子的模型假设，从而显著降低 gₘ 测量过程中对关键先验假设的依赖，使其能够适用于更广泛且更为复杂的环境条件。

CO₂ 的多维本质特性及其表征方式
大气中的 CO₂ 分子并非单一、均一的“标准形态”。在实际大气环境中，CO₂ 存在以多种同位素构形体分子（isotopologues）形式共存。

尽管超过 98% 的大气 CO₂ 以由 ¹²C 与两个 ¹⁶O 构成的 ¹²CO₂ 形式存在，但由于构成元素（碳、氧）天然具有不同中子数的同位素，因此不可避免地存在其他 CO₂ 同位素分子。

其中第二丰度形式约占 1.2%，为 ¹³CO₂，即由一个 ¹³C 与两个 ¹⁶O 构成的分子。由于同位素之间中子数存在差异，这些分子具有不同的分子质量，使得 ¹³CO₂ 相较于 ¹²CO₂ 略重，这一特征在后续讨论中具有重要意义。

此外，还存在少量其他 CO₂ 同位素分子，共同构成剩余约 0.8% 的大气 CO₂，但在本章讨论中其影响相对较小。

方程 11.10

其中，x₁ 与 x₂ 分别表示较轻同位素（¹²C）与较重同位素（¹³C）的“含量”。只要两者采用一致的计量单位，该比值即为无量纲量，因此 Υₓ 为无量纲参数。

在生物学尺度上具有生态学意义的同位素差异通常极其微小，往往出现在小数点后三位之后，即其变化幅度显著小于前述章节中讨论的 CO₂ 浓度变化。这类差异在数量级上亦明显低于 CO₂ 摩尔分数的生理响应变化。

因此，在早期稳定碳同位素测量中，通常采用相对于参考物质的表达方式，以弥补当时仪器精度有限及标准物质缺乏的问题（该限制在当前研究中仍部分存在）。尽管现代分析仪器性能已显著提升，目前碳同位素比值仍普遍采用相对于标准物质的表达方法进行报告：

方程 11.11

其中，δₓ 为标准化后的同位素比值（无量纲），Υstd 为标准参考物质的同位素比值。当样品相对于标准物质富集较重同位素（本例为 ¹³C）时，δₓ 为正值；当样品相对标准物质较贫化重同位素时，δₓ 为负值。

从历史发展来看，同位素标准物质最初来源于美国东南部 Pee Dee 盆地的一种碳酸盐沉积岩——Pee Dee Belemnite（PDB）。由于该天然标准材料现已耗尽，实际应用中通常采用其替代标准 Vienna Pee Dee Belemnite（VPDB）作为国际参考标准。商用仪器（如 LI-6878 叶肉导度测量系统）在进行 CO₂ 碳同位素计算时，通常采用 VPDB 的绝对同位素比值 ¹³C/¹²C = 0.0112372。

与 Υₓ 类似，在生物学尺度上 δₓ 的变化幅度仍然十分微小。实际应用中通常将 δₓ 乘以 1000，并以 ‰（千分比，per mil）表示，以避免使用过小的数值。例如，大气 CO₂ 的 Υ¹³C 约为 0.01114，对应 δ¹³C 约为 −8.5‰，表明大气 CO₂ 相较于 VPDB 标准在同位素组成上更“轻”（即 ¹³C 相对丰度较低）。在该尺度下，1‰ 的变化仅对应 Υ¹³C 约 1.1×10⁻⁵ 的变化量，相当于 CO₂ 同位素组成约千分之一量级的变化。

同位素分馏（Fractionation）
在物理及生物化学过程中（如扩散或酶促反应），不同同位素分子之间通常表现出一定程度的“选择性偏好”。该现象本质上源于同位素分子之间的质量差异，从而导致其在反应或传输过程中的动力学行为存在细微差别。

因此，在多数情况下，更关注的是：¹³C 与 ¹²C 的相对丰度在过程中的变化，而非其在某一时刻的绝对比值。

这种过程引起的相对组成变化，以及不同同位素在过程中被分离的程度，被定义为分馏（fractionation, αₓ，无量纲）：

方程 11.12

其中，下标 1 与 2 分别表示过程发生前（反应物状态）与发生后（产物状态）。

另一种等价表述是从生化过程对不同同位素分子的“选择性差异”出发，即同位素判别值（Discrimination, Δₓ）：

方程 11.13

在该表达形式中：

• 当生化过程优先偏好较轻同位素（¹²CO₂）时，Δₓ 为正值

• 当过程相对偏好较重同位素（¹³CO₂）时，Δₓ 为负值

扩散过程中的同位素分馏示例
以 CO₂ 通过气孔扩散为例，由于 ¹³CO₂ 的分子质量较大，其在气相中的扩散速率低于 ¹²CO₂。因此，当 CO₂ 通过气孔扩散时将发生同位素分馏，从而导致叶内外 CO₂ 同位素组成产生差异。

在纯扩散条件下：¹³CO₂ 的扩散系数约为 ¹²CO₂ 的 1/1.0044。因此在稳态条件下，叶内 CO₂ 库相对于叶外 CO₂ 将富集 ¹²CO₂ 。扩散分馏系数：adiff = 1.0044，对应同位素判别约为 4.4‰，即：若叶外空气 δ¹³C 为 −8.5‰，则叶内细胞间隙 CO₂ 的 δ¹³C 约为 −12.8‰。

同位素判别（Discrimination）在光合作用路径中的累积效应
在 CO₂ 从大气进入叶片并最终被 RuBisCO酶催化固定的整个过程中，同位素分馏判别持续发生：¹³CO₂ 在传输路径中持续受到相对抑制，导致植物光合产物中的 δ¹³C 通常显著低于大气中的δ¹³C 。该现象不仅体现在植物生物量中，也可在叶片与大气 CO₂ 之间的实时交换信号中观测到。

与光合作用机制的关系
RuBisCO 会强烈地排斥 ¹³CO₂ （约 29‰），但其实际影响程度取决于以下因素：

• CO₂ 到达 RuBisCO 的可达性

• 扩散过程与生化过程的限制程度

• 叶肉导度（gₘ）的调控作用

因此，同位素判别分馏不仅反映光合代谢过程的内在特性，同时也反映 CO₂ 在叶片内部的传输效率。

从同位素分馏判别到叶肉导度
叶肉导度的测量方法为：
将气体交换过程中观测得到的同位素判别值（Δobs），与基于生物物理过程模型计算的理论判别值（Δ₃）进行对比。

Δ₃ 模型
对于 C₃ 植物，其理论判别值模型（Δ₃，无量纲）如下：

方程 11.14

该方程用于描述 C₃ 植物中 CO₂ 从大气进入叶绿体并完成碳固定过程中，理论上将相关值代入即可得到同位素判别（Δ₃）。（注：该表达式包含呼吸与光呼吸等多项生理过程修正项。）

Δ₃ 模型的核心作用
该理论模型系统整合了以下过程对同位素判别值的贡献：

• 水汽–CO₂ 耦合效应（ω 修正）

• 边界层扩散（boundary layer, abl）

• 气孔扩散（stomatal diffusion, adif）

• 叶肉扩散（mesophyll conductance, am）

• 呼吸与光呼吸过程（Δ′e、Δf）

• RuBisCO 固碳分馏（Δ′RuB）

该方程从整体上表明：叶片光合作用过程中的同位素判别不仅由生化反应过程决定，同时也受到扩散路径结构及气体耦合过程的显著调控。

Δ₃ 模型中的参数
ω ，三元修正因子（ternary correction factor），为无量纲的修正系数，用于考虑 CO₂、水蒸气与空气在扩散过程中相互作用所引起的偏差。其核心含义为：在真实叶片气体交换过程中，扩散体系并非理想的二元体系（CO₂–空气），还会受到水汽通量影响的三元体系。

方程 11.15

其中：

• E：蒸腾速率（mol m⁻² s⁻¹）

• gtc：CO₂ 总导度（mol m⁻² s⁻¹）

• ā：CO₂在边界层和气孔扩散的加权分馏

ω 表征水气通量对 CO₂ 扩散路径的耦合干扰程度。当蒸腾作用增强时：气体扩散路径复杂性增加，CO₂ 与 H₂O 分子间耦合效应增强，同位素分馏行为偏离理想扩散假设。因此，在理论判别模型中必须引入 ω 进行修正。

方程 11.16

其中，P 为大气压（Pa），X′ca 与 X′cl 分别表示边界层外与细胞间隙空气中的 CO₂ 摩尔分数（mol mol⁻¹），Pcs 为叶片表面 CO₂ 分压（Pa）：

方程 11.17

其中，gblw 为以水汽表征的边界层导度（mol m⁻² s⁻¹）。

方程 11.14 与方程 11.16 中的 abl 与 adif 分别表示 CO₂ 在通过边界层传输与气孔扩散过程中，¹²CO₂ 与 ¹³CO₂ 之间的分馏系数（见表 11.1）。

方程 11.14 中的 am 表示 CO₂ 进入叶肉细胞过程中发生水合反应时的分馏效应（即 CO₂ 转化为 H₂CO₃ 并进一步生成 HCO₃⁻，见第 12 章“溶液中的 CO₂”）。

表 11.1

Δ′RuB（无量纲）表示羧化过程中的综合分馏效应，包括 RuBisCO 固碳反应及经 PEP 羧化酶（PEP-C）重新固定碳所产生的分馏：

方程 11.18

其中，T 为温度（K），fPEP 为呼吸释放 CO₂ 经 PEP-C 重新固定的比例（无量纲），ΔRuB 为 RuBisCO 的分馏（无量纲）。方程 11.18 中方括号项表示 PEP-C 相关分馏，该值通常假定为 −5.7‰，但由于 PEP-C 仅作用于 HCO₃⁻，其分馏效应具有温度依赖性，因此更适合采用该方程进行计算。

方程 11.14 中的 Δ′e（无量纲）表示白天呼吸过程中的有效分馏。在标准 C₃ 分馏模型中，通常假设呼吸底物的同位素组成保持恒定（即 Δ′ e= Δe，见表 11.1）。然而，当呼吸释放的碳来源于：在与模型假设条件不同环境下形成的同化产物时（在气体交换室实验中尤为常见），Δ′e与 Δe 可能不再一致（Δ′e≠ Δe）。为此，本章后续部分将给出对 Δ′e 的估算方法以进行修正。

方程 11.14 中其余项包括： Δf（光呼吸过程中的分馏，无量纲）、Pcc（叶绿体 CO₂ 分压，Pa）以及 Γ*（CO₂ 补偿点，Pa）。

上述方程 11.14 的形式基于一个假设：即光呼吸释放的 CO₂ 在叶绿体内部发生释放。尽管该假设在本研究框架下具有合理性，但在整体尺度上仍存在一定不确定性。对于希望进一步探讨该问题的读者，建议参考 Busch et al. (2020)，其中提出了一种替代模型，用于考虑光呼吸释放 CO₂ 与细胞质 CO₂ 混合的可能性。

与叶肉导度 gₘ 的关系（关键点）

在该理论框架中：

• Δ∞ = 理论最大判别（假设叶肉导度gₘ无穷大，Ci=Cc。由方程11.14计算而来。）

• Δobs = 实际观测到的同位素判别（由LI-6878叶肉导度测量系统获取）

二者之间的差异，反映 CO₂ 在叶肉扩散过程中的限制效应。因此可以认为：叶肉导度 gₘ 本质上是连接 Δ∞ 与 Δobs 的关键桥梁参数。

小结
综上所述，同位素分馏及同位素判别为解析 CO₂ 在叶片内部，从大气扩散至叶绿体并最终参与羧化固定的全过程，提供了一个高度敏感的示踪框架。在该框架中，扩散过程、生化反应以及气体耦合效应共同塑造了观测到的同位素信号，而叶肉导度（gₘ）则在连接理论判别（Δ∞ ）与实测判别（Δobs ）之间发挥了关键的中介作用。

因此，从理论层面来看，基于同位素判别反演叶肉导度的核心问题，本质上归结为对“过程驱动的同位素信号”与“观测信号”之间偏差来源的定量解析。这一分析框架不仅依赖于对扩散与酶促过程的参数化描述，也进一步对实验观测提出了更高要求，即需要能够在叶片气体交换过程中同步获取同位素组成信息。

在此背景下，一个关键问题随之出现：如何在气体交换测量的同时，实现对 CO₂ 同位素组成（δ¹³C）的高精度、连续或准连续观测？

这一问题的解决，将直接决定上述理论框架能否从“模型推断”走向“实验验证”，并进一步推动叶肉导度 gm 及相关同位素过程研究，从离线推断走向在线观测。

——未完待续

LI-6878 叶肉导度（gm）测量系统

LI-6878 将 LI-6800 便携式光合作用测量平台与 LI-7825 高精度 CO₂ 同位素分析技术深度融合，实现叶片光合气体交换、CO₂ 同位素以及叶肉导度（gm）的同步实时测量。使研究者能够在「野外原位」更系统、更精确地解析叶片内部碳扩散过程，从而全面揭示光合作用与气体传输机制。