CCM外泌体中试纯化中SEC‑TFF联用工作流的解析
2026-08-26 来源:本站 点击次数:76摘要：本文基于IZON Science团队发表于官方海报的研究数据，系统解析以细胞培养上清（CCM）为代表的复杂生物样本中外泌体/细胞外囊泡（EV）规模化纯化的完整工作流，为外泌体药物的中试放大与产业化提供可复制、可扩展的工艺参考。
关键词：外泌体、细胞外囊泡、细胞培养上清、SEC、尺寸排阻色谱、切向流过滤、qEV TFF、CCM、规模化纯化、qEV Zenco
外泌体中试放大｜面对CCM样本，SEC-TFF如何交出可重复工艺？
qEV220大规格SEC柱联合qEV TFF切向流过滤，破解高黏稠CCM规模化纯化瓶颈。海报数据显示：处理预浓缩的CCM可实现约15倍纯度提升与约96%蛋白去除，qEV Zenco自动化系统可保障连续20次运行的洗脱曲线高度一致，为外泌体治疗产品从中试到产业化提供可放大、可重复的标准化工艺路径。
一、为什么CCM外泌体纯化"这么难"？
外泌体/细胞外囊泡（EV）作为新一代药物递送载体和疾病标志物，其临床转化速度正受到"下游纯化"的严重制约。在众多样本类型中，细胞培养上清（Conditioned Cell Culture Medium,CCM）是外泌体药物开发与规模化生产的主要来源之一，却也恰恰是纯度挑战较大的来源之一。
CCM的典型难题可归纳为三点：
- 体积大、颗粒浓度低：规模化培养体系数升甚至数十升，而EV颗粒浓度相对较低，直接上样SEC柱效率低、耗时长。
- 蛋白负荷高：培养基中的血替组分或细胞分泌蛋白在CCM中大量残留，这些游离蛋白与外泌体粒径重叠严重，传统超速离心或沉淀法难以有效去除。
- 高黏度、难处理：浓缩后的CCM往往黏稠度高，直接过柱易造成柱床堵塞、流速不稳，影响回收率与批次一致性。
正因如此，规模化CCM外泌体纯化的诉求可概括为三点：先浓缩、再精纯、可放大。
二、海报研究概览：三种生物基质，一套可扩展的SEC-TFF工作流
2026年IZON Science团队（点击查看）。
发布的官方海报《Translating EV Isolation to Pilot Scale:A Validated SEC-TFF Workflow for High-Purity Processing Across Diverse Biofluids》系统展示了从qEV10到qEV500的SEC纯化柱与qEV TFF切向流过滤系统联用的中试放大工作流。
研究团队选取了三种理化性质截然不同的生物基质：鲜羊奶（脂质/酪蛋白丰富）、高度浓缩且高黏度的CCM（本文主要介绍CCM的处理），以及冻存血浆。通过"预处理澄清→qEV TFF浓缩/换液→SEC纯化"的标准化工作流，研究团队验证了该体系的普适性与稳健性。颗粒浓度通过Exoid可调电阻脉冲传感（TRPS）测定，颗粒蛋白比通过BCA蛋白定量计算。
| 阶段 | 操作 | 关键设备/耗材 | 目的 |
|---|---|---|---|
| 预处理 | 5×稀释→澄清→qEV TFF10×浓缩 | qEV TFF（推荐300kDa MWCO膜） | 降低黏度、去除细胞碎片与大颗粒、富集EV、完成缓冲液置换 |
| SEC纯化 | qEV220（35nm或70nm树脂） | qEV220大规格SEC柱+qEV Zenco | 利用尺寸排阻色谱去除游离蛋白与小分子杂质，获得高纯度EV |
| SEC纯化 | UV在线监测+自动馏分收集 | qEV Zenco自动化层析系统 | 稳定流速、自动截取EV富集峰、生成可追溯工艺报告 |
图1. CCM样本的qEV220 SEC-TFF工作流总览
图2. CCM样本的qEV220工作流总览
三、CCM处理的流程详解
3.1 预处理：稀释、澄清与qEV TFF预浓缩
- 5×稀释：降低CCM黏度；
- 澄清：去除细胞碎片、大颗粒聚集体，防止堵塞；
- qEV TFF10×浓缩：在保持低剪切力的同时，将大体积CCM浓缩至适合qEV220上样的体积，同时完成部分小分子蛋白与缓冲液的置换。
qEV220是IZON面向中试放大设计的大规格SEC柱。海报中CCM样本采用qEV220 35nm树脂（具体树脂孔径取决于目标EV尺寸与纯度需求）。SEC的分离原理简单：大颗粒EV无法进入琼脂糖树脂孔道，沿柱床间隙快速流出；而小分子游离蛋白则进入孔道，在柱中滞留更久。通过分子筛效应，qEV220将目标EV与高丰度污染蛋白有效分离。
本研究中，qEV220对CCM的处理规模为5.4L（客户预浓缩样品）→9.9L（纯化后收集液），实现了约15倍纯度提升和约96%蛋白去除。
3.3自动化：qEV Zenco让工艺"可重复、可追溯"
当样本量上升到中试或生产级别，手动收集已不可持续。qEV Zenco自动化层析系统集成了UV在线监测、流速控制与馏分自动收集。在本海报中，qEV Zenco连续运行22次，获得了高度一致的洗脱曲线，充分体现了柱效与自动化系统的稳健性。
图3. qEV220连续运行多轮UV吸收峰
四、关键数据解读：CCM各步骤的浓度、蛋白与纯度变化
海报为CCM（qEV220）提供了从粗样品到qEV纯化样品的完整数据链。汇总了各步骤的颗粒浓度（使用TRPS技术检测）、蛋白浓度（BCA法检测）以及颗粒:蛋白纯度。
| 处理步骤 | 颗粒浓度(particles/mL) | 蛋白浓度(µg/mL) | 纯度(particles/µg protein) |
|---|---|---|---|
| Raw（粗样品） | 1.30×10¹3 | 15300 | 8.5×108 |
| Clarified（澄清后） | 1.51×10¹2 | 14307 | 1.06×108 |
| Post-TFF（TFF浓缩后） | 1.81×10¹3 | 86619 | 2.09×108 |
| qEV Purified（qEV纯化后） | 8.68×10¹2 | 6000 | 1.29×10⁹ |
图4. CCM（qEV220）各处理步骤颗粒浓度、蛋白浓度与纯度变化，数据来源：IZONScience官方海报《TranslatingEVIsolationtoPilotScale》（Li Y,et al.）
4.1 TFF浓缩阶段：富集EV，但不除蛋白
Post-TFF步骤使颗粒浓度从1.51×10¹2提升到1.81×10¹3particles/mL，这一步TFF的作用是"浓缩"而非"精纯"——它让原本稀释的EV进入可被SEC处理的体积范围，但并未明显改变颗粒/蛋白比例。
4.2 qEV SEC阶段：真正的蛋白去除发生在这里
qEV220纯化后，蛋白浓度降至6000µg/mL，海报报告约96%的蛋白质去除和约15倍纯度提升。
4.3EV回收可观
qEV纯化后颗粒浓度为8.68×10¹2particles/mL，虽然低于Post-TFF的1.81×10¹3（因SEC后样品被缓冲液稀释），但蛋白去除率较高，回收水平符合SEC工艺预期，且远高于未经纯化的粗样品。
五、稳健性与规模化：qEV220的20次连续运行验证
对于外泌体药物生产而言，单批次纯化结果好并不能满足要求，工艺必须"经得起重复"。海报数据显示，通过qEV Zenco自动化系统，qEV220实现了连续20次运行的稳定洗脱曲线，无明显柱效衰减。这一结果证明qEV220大规格SEC柱在中试放大场景下具备：
- 长期复用能力：降低单次生产成本；
- 自动化适配能力：与qEV Zenco无缝对接，减少人为误差；
- 规模覆盖能力：从qEV10（100mL级）到qEV220（5L级以上）再到qEV500（更大规模），形成线性放大路径。
六、结论与转化意义
基于IZON官方海报，可以得到以下关键结论：
- SEC-TFF联用是CCM外泌体规模化纯化的有效策略：TFF解决"体积太大"和"样品太稀"的问题，SEC解决"蛋白太多"的问题，两者互补，缺一不可。
- SEC可处理高黏稠、高蛋白的预浓缩CCM：qEV220仍能实现约15倍纯度提升和约96%蛋白去除。
- 自动化是工艺稳健性的关键：qEV Zenco保障20次连续运行的重现性，为中试与生产提供可追溯、符合合规趋势的数据基础。
- 具备跨基质扩展能力：同一套qEV SEC-TFF工作流，可以从qEV10到qEV220线性放大，说明工艺可在同一套体系上逐步放大。
对于外泌体药物开发者而言，这意味着：从小试到中试的工艺放大，不再是"重新开发一条工艺"，而是在同一套qEV体系上逐步放大体积、接入自动化，实现"方法从小试直接平移到GMP"的愿景。
关于IZON Science
IZON Science总部位于新西兰，是全球纳米颗粒分离与分析解决方案提供商。其qEV系列SEC分离柱、qEVTFF切向流过滤系统、qEVZenco自动化层析系统以及ExoidTRPS单颗粒分析仪，构成了从外泌体分离纯化到单颗粒表征的完整技术闭环。上海曼博生物（MineBio）是IZON Science在中国区域的官方合作伙伴，可提供qEV全系列纯化柱、自动化纯化系统及Exoid/Pulsoid表征设备的销售、技术支持和本地化服务（点击查看）。
参考文献
1. Li Y, Pal VK, Mauleon G, Marchioni M, Severi C, Xuan B. Translating EV Isolation to Pilot Scale: A Validated SEC-TFF Workflow for High-Purity Processing Across Diverse Biofluids [Poster]. Izon Science; 202X.
2. Böing AN, et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 2014;3:23430.
拓展阅读
IZON外泌体与纳米颗粒纯化表征技术专栏
本文基于公开资料由IZON Science中国官方合作伙伴上海曼博生物整理，原文/数据来源：Li Y,et al.,Izon Science US LLC/Izon Science Europe SAS；IZON Science官网，仅用于科研信息分享，不构成产品性能担保或医疗建议。上海曼博生物可提供qEV系列外泌体纯化柱(点击查看)（qEVsingle/qEVoriginal/qEV1/qEV2/qEV10/qEV100）、全自动纯化系统（AFC V2/qEV DXter/qEV Zenco/qEV TFF）及Exoid/Pulsoid纳米颗粒分析仪等全系列产品。欢迎咨询!