结直肠癌是全球发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一，肝转移是导致患者预后不良甚至死亡的主要原因。现有治疗手段对已发生肝转移的患者效果有限，亟需揭示其背后的分子机制。N-糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与肿瘤转移的多个环节，但在结直肠癌肝转移中的全局性变化尚不清楚。因此，系统解析原发灶与肝转移灶之间的N-糖基化修饰差异，有望发现关键调控分子，为临床诊疗提供新靶点。

文献解析
研究成果展示      
▶ 发表时间：2025年12月24日
▶ 期刊： Advanced science（IF 14.1）
▶ 文章标题：
N-glycosylation Modification of CTSD Affects Liver Metastases in Colorectal Cancer
▶ 核心内容：
北京大学人民医院团队联合多中心，通过基于质谱的N-糖基化蛋白质组学技术，系统分析了结直肠癌患者原发灶与配对肝转移灶的差异修饰图谱，并结合免疫共沉淀-质谱（IP-MS）相互作用组学与定量蛋白质组学，筛选并验证了调控肝转移的关键分子CTSD。研究首次证实，CTSD第263位天冬酰胺（N263）位点的N-糖基化修饰在肝转移灶中显著上调，其缺失可完全阻断肝转移；进一步鉴定出糖基转移酶复合物DDOST/STT3B为核心调控元件，并揭示CTSD通过降解ACADM调控铁死亡通路（ACSL4、SLC7A11、GPX4）的促转移新机制。该研究为结直肠癌肝转移的早期干预与靶向治疗提供了全新标志物和潜在靶点。

研究方法
本研究收集结直肠癌患者原发灶与配对肝转移灶组织，借助LC-MS开展 N-糖基化蛋白质组学分析，筛选出核心分子CTSD；通过定点突变、慢病毒转染构建细胞模型，结合 PNGase F、衣霉素处理证实 CTSD 存在 N - 糖基化修饰，并验证其第 263 位糖基化可改变蛋白定位、稳定性与酶活性；利用免疫共沉淀、质谱及基因敲低实验，确定 STT3B 与 DDOST 是调控该位点糖基化的糖基转移酶；再经差异蛋白筛选、互作验证及通路检测发现，糖基化活化的 CTSD 可降解 ACADM，进而调控铁死亡相关蛋白表达；最后通过细胞功能实验与裸鼠皮下成瘤、肝转移模型，在体外和体内证实 CTSD 第 263 位 N - 糖基化经 ACADM / 铁死亡轴促进结直肠癌增殖、侵袭与肝转移，并结合生物信息学与统计学方法完成数据分析与结果验证。

研究结果
1. 结直肠癌原发灶与配对肝转移灶的N-糖基化蛋白图谱
收集14对结直肠癌原发灶与配对肝转移灶组织，经HILIC-SPE富集N-糖肽后进行LC-MS/MS分析。结果鉴定到139个N-糖基化蛋白和185个修饰位点，其中CTSD第263位天冬酰胺（N263）位点的糖基化在肝转移灶中显著升高，差异倍数最大；独立5对患者WB验证也证实该趋势。结论表明CTSD N263位点N-糖基化与结直肠癌肝转移密切相关，是潜在的驱动因子。

图1. 结直肠癌原发灶与配对肝转移灶样本的糖蛋白组学组学结果

2. CTSD N-糖基化位点突变体的构建及其对CRC细胞生物学行为的调控
通过定点突变将CTSD第134位和/或263位天冬酰胺替换为谷氨酰胺（N134Q、N263Q及双突变体），利用shRNA沉默SW480/SW620内源性CTSD后转染野生型或突变型质粒，成功构建糖基化缺陷型稳定细胞系。功能实验采用CCK-8、EdU、Transwell及流式细胞术评估细胞表型。结果显示突变体细胞增殖速率显著降低、穿过Matrigel的侵袭细胞数减少约60%、凋亡率明显升高。结论表明CTSD N263位点N-糖基化修饰是维持结直肠癌细胞增殖、侵袭及抗凋亡能力的关键因素，突变阻断该修饰可有效抑制恶性表型。

图2 CTSD糖基化缺失阻断肝转移

3. 鉴定CTSD的N-糖基转移酶STT3B与DDOST
利用FLAG磁珠免疫共沉淀联合质谱（IP-MS）筛选CTSD互作蛋白，并通过CRISPR敲除及免疫荧光共定位进行验证，同时结合定量蛋白质组学对相关通路进行深度解析。结果发现DDOST为唯 /一特异性结合的糖基转移酶，敲除STT3B或DDOST后CTSD分子量明显下降，且二者与CTSD共定位。结论表明STT3B（催化亚基）与DDOST（非催化亚基）共同调控CTSD N263位点的N-糖基化修饰。

图3. 鉴定CTSD的糖基转移酶STT3B/DDOST

4. CTSD糖基化通过ACADM/铁死亡轴调控CRC进展
对野生型与N263Q细胞进行定量蛋白质组学分析，结合Co-IP、WB及90例组织IHC验证。结果显示ACADM在N263Q细胞中显著升高并与CTSD直接结合，GPX4/SLC7A11下调、ACSL4上调，CTSD与ACADM表达呈负相关。结论是CTSD通过N-糖基化依赖的蛋白酶活性降解ACADM，进而调控铁死亡通路促进CRC进展与肝转移。

图4. CTSD通过ACADM/铁死亡轴促进CRC进展

研究结论
本研究通过N-糖基化蛋白质组学分析，首次绘制了结直肠癌原发灶与配对肝转移灶的N-糖基化修饰图谱，筛选并证实CTSD第263位天冬酰胺（N263）位点的N-糖基化修饰在肝转移灶中显著上调。通过定点突变构建糖基化缺陷型细胞系，结合体内外功能实验，证明CTSD N263糖基化缺失可显著抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭与抗凋亡能力，完全阻断裸鼠肝转移。机制上，免疫共沉淀-质谱鉴定出糖基转移酶复合物STT3B/DDOST协同调控CTSD N263糖基化；该修饰缺失导致CTSD无法正常转运至溶酶体，稳定性与蛋白酶活性显著下降，进而减少对ACADM的降解，上调铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11并下调ACSL4，最终抑制结直肠癌进展与肝转移。本研究为结直肠癌肝转移的早期干预与靶向治疗提供了全新标志物和潜在靶点。