自发光模式-小鼠成像完全没信号

一、底物注射与处理

这是生物发光实验最关键的一步，问题也最常出在这里。

①底物活性：D-荧光素底物对光和温度敏感。需要-20℃避光保存，用前新鲜配制，并且要避光操作。反复冻融或配制后放置太久都会导致底物降解，信号自然就没有了。

②剂量和浓度：常规腹腔注射剂量是150mg/kg体重。可以按10µl/g的注射量来推算，比如20g的小鼠注射200µl。

③反应时间：腹腔注射后，需要等待10-20分钟，让底物在体内充分反应，信号才能达到峰值。时间太短或太长信号都会很弱。如果不确定，可以做预实验，在注射后5、10、15、20、30分钟分别拍一张，找到信号达峰的时间点。

④注射方式：腹腔注射（IP）操作简单，信号稳定；尾静脉注射（IV）信号更强、更快，但操作难度大。如果刚换注射方式，可能需要重新摸索最佳成像时间。

底物注射与成像时机示意图

二、动物准备与状态

动物本身的状态会极大影响成像质量。

①脱毛程度：毛发会严重阻挡光信号，可能导致荧光强度降低50%以上。成像前一定要彻底脱毛，尤其是观察部位。

②饲料干扰：常规鼠粮里的苜蓿等成分会产生背景荧光，干扰成像。如果背景很亮或者信号不清，可以考虑禁食或换成无荧光的特殊饲料。

③麻醉和保温：麻醉过深会抑制小鼠代谢，影响发光反应。同时，成像平台必须用37°C加热垫保温，体温过低同样会影响代谢和信号。

脱毛程度对成像的影响

图注：去毛能显著提升表面荧光成像信号；毛发同时阻挡激发与发射光，腹部去毛后注射点荧光明显增强。

三、仪器参数设置

错误的设置会让微弱的信号被忽略。

①曝光时长：生物发光信号弱，需要较长的曝光时间，通常设置为1-5分钟。如果自动曝光（最长60秒）没信号，可以尝试手动设置更长的曝光时间，比如120秒。

②滤光片和Binning设置：生物发光成像应选择Open滤光片。为了提高灵敏度，可以设置较大的Binning值，比如4×4或8×8。

③滤光片：如果是荧光成像，需要确保激发/发射滤光片与所用染料的波长匹配。

光仪活体成像系统软件操作界面截图

四、模型与对照

如果以上步骤都确认无误，问题可能出在实验模型本身。阳性/阴性对照怎么做？这是判断问题出在哪的关键。

①阳性对照：用已知能稳定发光的细胞或动物模型，如果阳性对照也没信号，说明实验体系（底物、仪器设置等）有问题。

②阴性对照：用未标记的普通小鼠，用来评估背景信号水平。

③细胞标记状态：如果刚建立了新的稳转细胞系，需要确认荧光素酶基因是否成功整合并表达。可以先做体外（in vitro）的荧光素酶活性检测（如Western Blot或荧光素酶报告基因检测），确认细胞本身没问题再用于活体成像。

生物发光模型阳性与空白对照

图注：图示为生物发光成像对照成像。左侧luc荷瘤小鼠可检测到特异性生物发光信号；右侧Con空白对照小鼠无明显发光信号，用于区分真实目标信号与背景噪声，验证模型有效性。

 

荧光模式

一、目标很弱，几乎看不到

主要原因：

1. 滤片选错：激发 / 发射波段与染料不匹配；

2. 探针浓度偏低、探针淬灭、降解；

3. 毛发遮挡、未脱毛，光被吸收散射；

4. 深层肿瘤 / 靶组织，组织吸收衰减；

5. 相机参数：曝光时间太短、光圈小、binning 太小

成像图靶区荧光信号偏弱

图注：活体荧光成像示例，靶区仅有微弱荧光信号，提示目标信号检出困难。

解决方案：

1. 核对染料光谱，确认激发、发射滤片；

2. 染料避光保存，避免反复冻融；优化给药剂量；

3. 成像区域彻底剃毛 + 脱毛膏处理；

4. 深层样本优先选用近红外染料 Cy5.5/Cy7，避开绿光通道；

5. 适度增大光圈、增加曝光，合理调binning，不要无限拉高曝光（放大噪声）。

二、背景很高、信噪比差，整张图很亮，分不清目标信号

主要原因：

1. 动物自发荧光（毛发、皮肤胶原、NADH；尿液粪便污染体表；普通苜蓿饲料消化道荧光）；

2. 探针非特异性富集于肝脏、脾等网状内皮系统器官；

3. 激发光散射漏光；

4. 短波长（GFP/FITC）本身背景就大。

自发荧光造成高背景，干扰目标识别
图注：小鼠活体荧光成像实例，空白小鼠（左）体表存在大面积自发荧光，属于自发光干扰信号，易误判为目标信号。

解决方案：

1. 成像区域充分脱毛；体表擦干净尿液粪便；

2. 腹部成像：提前 3-7 天更换无苜蓿低荧光饲料；

3. 优先切换近红外窗口＞650 nm，大幅压低自发荧光；

4. 设置阴性对照（不给探针的同品系小鼠）做背景扣除；

5. 优化滤片，增大斯托克斯位移，减少激发光泄露。

三、出现假阳性：没有给药的小鼠也出现明显荧光信号

主要原因：

1. 皮毛、排泄物、垫料的自发荧光；

2. 成像台有染料残留污染；

3. 滤片串光，激发光直接漏入探测；

4. 短波长通道极易出现该问题。

荧光成像假阳性信号示例（给药鼠与空白对照鼠对比）

解决方案：

1. 每次实验结束，75% 乙醇擦拭成像台；

2. 必须设置空白动物对照组；

3. 校验滤片组；优先近红外染料；

4. 不要把尿液粪便留在成像视野内。

四、多通道成像：通道之间发生串扰（光谱串色）

主要原因：

两种染料发射光谱互相重叠；滤片带宽选择不合理。

两种荧光染料发射光谱重叠引发通道光谱串扰示意图

解决方案：

1. 两套染料发射波长尽量间隔≥100 nm；

2. 采用顺序采集模式，不要同时双激发；

3. 做光谱拆分（如有光谱模块）；

4. 单染料对照，做串色校正矩阵。

五、信号位置异常，分布和预期不一致

主要原因：

1. 注射失败：尾静脉渗漏、腹腔注射漏到皮下；

2. 探针体内代谢，网状内皮系统（肝脾）富集；

3. 动物体位移动；

4. 染料聚集沉淀，没有充分溶解。

离体器官荧光成像显示探针非特异性富集
图注：图示为小鼠离体器官荧光成像，预期靶信号位于肝脏，但探针大量非特异性富集于肠道，信号分布与实验预期不一致，造成目标判读困难。

解决方案：

1. 注射完成确认无外渗；尾静脉注射确认回抽回血；

2. 摸清探针动力学，选最佳成像时间点；

3. 麻醉深度充足，固定动物体位；

4. 染料充分溶解，避免析出聚集。

六、同一批动物，组间重复性很差，数据波动大

主要原因：

1. 给药操作不一致（注射剂量、渗漏）；

2. 脱毛程度不一致；

3. 成像时间点不统一（探针体内代谢动力学窗口窄）；

4. 每次成像参数不一致；

5. 动物个体代谢差异。

同批次小鼠活体荧光成像
图注：图示为同批次荷瘤小鼠活体荧光成像，肿瘤区域荧光信号波动大，组间重复性差；尾部为注射位点残留信号。

解决方案：

1. 统一注射方式、剂量；杜绝渗漏；

2. 所有小鼠同一部位标准化脱毛；

3. 给药后严格固定等待时间再成像；

4. 同一批实验曝光、光源功率、binning 全部锁定，不随意改动；

5. 增加生物学重复。

七、只能看表层，深部病灶几乎检测不到

主要原因：

可见光（红、绿、蓝）被血红蛋白大量吸收散射；组织穿透差。

生物组织对不同波长光的吸收特性示意图

生物组织对不同波长光的吸收特性示意图

解决方案：

1. >650 nm 近红外窗口染料 Cy5.5、Cy7、ICG；

2. 降低短波长荧光（GFP/FITC）用于深部体内检测的预期；

3. 浅层皮下肿瘤可以用绿光通道。

八、探针光照淬灭，多次采集信号越来越低

主要原因：

长时间强激发光照射，光漂白。

连续多次激发采集信号衰减

解决方案：

减少激发光功率，缩短单次曝光；间隔采集，不要连续反复激发同一位置；选择抗光漂白更好的探针。

部分参考文献：

[1] Su, Y., Walker, J. R., Park, Y., Smith, T. P., Liu, L. X., Hall, M. P., Labanieh, L., Hurst, R., Wang, D. C., Encell, L. P., Kim, N., Zhang, F., Kay, M. A., Casey, K. M., Majzner, R. G., Cochran, J. R., Mackall, C. L., Kirkland, T. A., & Lin, M. Z. (2020). Novel NanoLuc substrates enable bright two-population bioluminescence imaging in animals. Nature Methods, 17(8), 852–860. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0889-6

[2] Fichtner, J., Wagenhäuser, Y., Sárosi, M., Stolte, M., & Würthner, F. (2026). Fluorescent merocyanines: from fundamental properties to applications as molecular probes, in bioimaging and as emissive dye aggregates. Chemical Society Reviews. https://doi.org/10.1039/D6CS00194G

[3] Mu, H., Miki, K., & Ohe, K. (2021). pH-Activatable cyanine dyes for selective tumor imaging using near-infrared fluorescence and photoacoustic modalities. ACS Sensors, 6(1), 123–129. https://doi.org/10.1021/acssensors.0c01926

部分图片来源：

[1]https://resources.revvity.com/pdfs/tch-ivis-spectrumct-general-and-technical-considerations-for-2D-and-3D-imaging.pdf（Figure 6）

[2] Li L, et al. Engineered αvβ6-targeting peptide‒BSH conjugates for boron neutron capture therapy of pancreatic ductal adenocarcinoma [J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2026.（Figure 5）