组织透明化技术结合免疫标记与三维高分辨率成像，为解析组织神经分布提供有力手段，但膝关节这类关节结构内神经纤维的可视化仍存在技术壁垒。现有透明化方案大多针对小鼠样本优化，难以适配大鼠这类组织体积更大的实验动物。该研究对比改良PEGASOS方案与全新混合透明化方案c‑Clear，利用三维荧光成像观察大鼠膝关节内神经丝阳性神经纤维，证实c‑Clear更适合大鼠膝关节神经纤维检测；同时研究指出多角度光片成像，对解析膝关节复杂微环境下神经支配空间分布具备重要意义。

该研究由 Mairobys Socorro、Janak Gaire、Juliane Rolim de Lavor、Yenisel Cruz‑Almeida、Robert M. Caudle、Reese Smith、Simon C. Watkins、Kyle D. Allen、RE‑JOIN Consortium*、Alan M. Watson 与 Alejandro J. Almarza 完成，文章标题为“Advanced tissue clearing and three‑dimensional imaging approaches to visualize neural innervation in the rat knee joints”，2026年5月在线发表于 《npj Imaging》。

重要发现

01实验前期抗体有效性验证
正式三维透明化实验开展前，研究利用大鼠三叉神经节、坐骨神经、脱钙膝关节的二维组织切片完成神经丝抗体的特异性与工作稀释度验证。大鼠膝关节样本的固定、脱钙处理与三维实验保持一致，二维样本后续进行蔗糖脱水包埋切片，封闭、一抗二抗孵育等免疫标记条件与三维实验保持接近。三叉神经节与坐骨神经作为阳性对照，可产生稳定特异性荧光信号，膝关节切片中也可在软骨下骨髓区域观察到神经丝阳性信号，阴性对照无特异性信号，确认抗体可用于后续三维透明化样本的神经标记。实验采用Immunocal脱钙液完成骨组织脱钙，对比传统10% EDTA脱钙，该脱钙液可以在7‑9天实现大鼠膝关节完全脱钙，同时不破坏抗原表位，不会降低神经丝的荧光信号强度。

特异性和最佳工作的二维（2-D）验证用于染色细胞核（蓝色）

02两种组织透明化方案的流程构建
c‑Clear为CUBIC与3DISCO结合的水相‑有机溶剂混合透明化方案，流程包含固定、脱钙、脱色、免疫标记、脱水脱脂、折射率匹配，在免疫标记之前增设独创的光漂白步骤。样本首先经过CUBIC‑R1试剂完成脱色，去除血红素等吸光物质，再经过四氢呋喃梯度脱水脱脂，浸入二苄醚，使用488nm高强度光源对样本进行8小时光漂白，降低肌肉、骨髓固有的自发荧光。光漂白完成后样本进行梯度复水，再开展三维免疫标记；标记结束后再次进行四氢呋喃梯度脱水，二氯甲烷强化脱脂，最终浸入二苄醚完成折射率匹配实现组织透明。

用于绘制大鼠膝关节感觉神经分布的组织透明化和免疫染色技术

经抗神经丝（NF）一抗标记并通过PEGASOS技术透明化处理的完整大鼠膝关节三维（3-D）荧光视频

经 c‑Clear 透明化处理、抗神经丝（NF，泛神经元标记物）一抗标记的完整大鼠膝关节样本，浸泡于二苄醚透明介质中，采用 mesoSPIM 光片显微镜进行冠状面成像

完整大鼠膝关节的三维（3D）荧光成像，该膝关节经处理后可实现对组织结构的精准分析与解读

改良PEGASOS属于溶剂型透明化方案，样本脱钙之后进行脱色、氨水处理，再完成封闭、一抗与二抗孵育，之后通过叔丁醇梯度完成脱水脱脂，最后使用BB‑PEG介质完成折射率匹配实现透明。两种方案均支持完整膝关节、矢状对半切开膝关节、四分之一膝关节多种样本形态的处理。

03三维成像对比与样本尺寸的影响
研究采用mesoSPIM光片成像设备开展大体积样本三维重建，同时对比带状扫描共聚焦成像的表现。PEGASOS处理后的样本虽然可以实现组织透明并标记神经丝阳性纤维，但肌肉与骨髓区域自发荧光信号较强，会干扰神经纤维信号识别。c‑Clear方案凭借前置光漂白步骤，显著压制背景自发荧光，提升信噪比，更利于识别细的神经丝阳性神经纤维。647nm波段二抗荧光基团相比500nm波段，能够获得更高信噪比。

经矢状位观察的半只大鼠膝关节中NF标记神经的三维可视化图像

单一的冠状面扫描会丢失膝关节后侧的神经信号，采用冠状、矢状、后侧多角度扫描，能够完整采集膝关节全部区域的神经支配信息。完整膝关节样本中抗体难以完全渗透软骨与骨深层，对半切开、四分之一分割的样本可以提升抗体渗透效率，c‑Clear组可以在骨皮质骨膜、骨小梁骨内膜观察到神经丝阳性神经纤维，PEGASOS组这类信号检出较少。mesoSPIM适配厘米级大体积样本，成像速度更快；带状扫描共聚焦横向分辨率更高，但成像轴向深度有限，更适合半膝关节这类厚度更小的样本，获取精细神经细节。

04实验最终结论
相较改良PEGASOS，c‑Clear混合透明化方案能够有效降低大鼠膝关节样本骨髓、肌肉的自发荧光，提升神经丝阳性神经纤维的成像信噪比，适合大鼠膝关节大体积样本三维神经支配图谱绘制。对大体积复杂关节组织，多角度光片扫描是获取完整神经空间分布信息的必要手段；将大样本进行对半、四分之一分割，可改善抗体渗透，提升骨组织内部神经纤维的检出效率。

整个大鼠膝关节的三维（3-D）荧光图像清除了组织结构的准确分析和解释。黄色星号与c-Clear并用抗神经丝一抗标记

用两种不同的清除方法清除并在后平面扫描的整个大鼠膝关节的代表性图像

c-Clear组织透明技术提升了PEGASOS方案中神经丝（NF）的检测效果

创新与亮点
该研究解决了大鼠膝关节这类异质性高、软硬组织共存大样本的透明化成像难题。传统小鼠优化的透明化方案用于大鼠膝关节，会面临自发荧光干扰、抗体渗透不足的问题。c‑Clear融合CUBIC水相与3DISCO溶剂透明化的优势，创新引入免疫标记前光漂白流程，抑制肌肉、骨髓自发荧光，兼顾组织形态保存与神经荧光标记质量。

该技术可以用于骨关节炎等关节慢性疼痛模型的神经三维图谱解析，助力解析外周神经重塑与慢性疼痛的关联，也为向人类大体积关节组织样本的三维成像转化提供方法学参考。但c‑Clear会淬灭内源荧光蛋白，不适合依赖转基因荧光报告基因的实验，同时整体样本处理周期较长，仍存在优化空间。

总结与展望
该研究建立c‑Clear混合组织透明化方案，完成大鼠膝关节神经丝阳性神经纤维三维可视化，对比PEGASOS方案证实c‑Clear在压制自发荧光、神经纤维检出方面的优势，同时明确多角度成像、样本分割对复杂关节组织三维成像的价值。后续可以进一步优化试剂与流程缩短处理时长，还可以联合多种抗体同时标记软骨、骨等解剖结构，完善关节多组织三维图谱，助力关节慢性疼痛病理机制解析与新型治疗靶点开发。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。

Socorro, M., Gaire, J., Rolim de Lavor, J. et al. Advanced tissue clearing and three-dimensional imaging approaches to visualize neural innervation in the rat knee joints. npj Imaging 4, 40 (2026).

doi:https://doi.org/10.1038/s44303-026-00167-6