颅骨神经与血管共同调控颅骨的发育与损伤修复，但目前尚不清楚出生后生长及衰老过程中颅骨神经的三维空间分布规律。受完整骨组织三维结构定量检测手段限制，颅骨神经的空间特征一直难以解析。该研究采用光片显微镜对神经、内皮细胞进行成像，结合机器学习分割技术，对小鼠从出生后第0天至80周生命周期内的颅骨神经‑血管构筑开展三维定量表征，同时结合Apert综合征疾病模型探究颅缝相关病变对神经血管结构的影响。研究揭示衰老会改变颅骨神经密度，颅骨神经与特定血管亚型存在空间关联，为理解颅骨稳态、衰老相关骨改变提供三维时空层面的实验依据。

本研究由 Allison L. Horenberg、Yunke Ren、Eric Z. Zeng、Alexandra N. Rindone、Arvind P. Pathak、Warren L. Grayson 完成，论文题目为《3D imaging reveals changes in the neurovascular architecture of the murine calvarium with aging》，发表于《Bone Research》。

重要发现

01三维光片成像工作流实现颅骨神经完整可视化
过往研究主要依靠冷冻切片二维成像观察颅骨神经，切片制备会破坏组织原始三维结构，难以对完整颅骨内神经网络开展定量分析。本研究采用定量光片显微镜成像工作流，在不脱钙条件下使用2,2‑硫代二乙醇开展组织透明处理，实现全小鼠颅骨的三维成像。

定量光片显微镜（QLSM）实现了颅神经的三维可视化

小鼠生命周期中\(TUBB3+\)神经分布的变化

由于小鼠颅骨会随年龄增长产生背景光学信号干扰，研究搭建基于机器学习的图像分割处理流程：将成像原始数据完成拼接、感兴趣区域裁剪，导出至图像分析软件完成通道拆分，再通过机器学习工具完成神经结构分割，分割结果回传至三维分析软件开展体积、空间位置统计。该流程可以有效压制背景噪声，相比直接三维软件分割，神经结构识别准确度更高。对照共聚焦成像结果验证，该成像方案可以捕获绝大多数TUBB3阳性神经纤维，保障后续定量分析的可靠性。借助这套成像分析流程，可以区分定位在骨膜与硬脑膜两个不同解剖位置的神经，实现分区域的神经定量统计。

02Apert综合征模型颅骨神经血管构筑检测
研究利用携带Fgfr2^+/P253R突变的Apert综合征小鼠模型，该疾病以颅缝提前闭合为特征。对新生野生型与突变小鼠颅骨开展定量光片成像对比。从总体神经密度、分区域神经分布，到骨膜、硬脑膜神经占比，以及血管亚型组成、神经‑血管空间关联，突变小鼠与野生型均未检测出统计学差异。结果提示，颅缝提前闭合本身并不会直接造成颅骨神经、血管网络的结构紊乱。

血管表型与\(TUBB3+\)神经之间的空间相关性

阿佩尔综合征患者神经血管分布的变化

创新与亮点
该研究突破传统组织切片只能获取二维局部信息的局限，建立不脱钙完整颅骨的定量光片成像联合机器学习分割工作流，解决完整颅骨组织内神经网络三维定量的技术难题。该技术能够保留颅骨原始几何形态，实现全颅骨范围多区域、多神经亚型、血管亚型的同步空间定量。

该成像方案可用于解析发育、衰老、遗传性颅面骨疾病下颅骨微环境的神经血管变化，为颅骨损伤修复、颅缝早闭疾病、头痛相关病理机制研究提供三维成像分析手段，也为骨神经血管相关动物实验提供标准化定量成像范式。

总结与展望
该工作借助三维光片成像与机器学习分割，完整刻画小鼠全生命周期颅骨神经‑血管三维时空特征，证实额骨神经衰老丢失早于顶骨，神经对H型血管存在固有空间偏好，Apert综合征颅缝闭合不会直接破坏颅骨神经血管架构。后续可依托该成像平台，进一步解析神经‑血管信号交互分子机制，拓展更多颅骨相关疾病模型的微环境研究。

论文信息

声明：本文仅用作学术目的。

Horenberg, A.L., Ren, Y., Zeng, E.Z. et al. 3D imaging reveals changes in the neurovascular architecture of the murine calvarium with aging. Bone Res 13, 24 (2025).

doi:https://doi.org/10.1038/s41413-025-00401-8