细胞内源性发色团（如代谢辅酶 NADH 和 FAD）是反映细胞代谢状态的重要标志物，但传统自发荧光成像受限于低量子产率与光谱重叠，灵敏度和分子特异性不足。该研究提出一种双光子光热显微成像方法，通过检测发色团双光子吸收后产生的局部热瞬态而非荧光发射，实现了对 NADH 和 FAD 的亚微摩尔级检测，并在单细胞和三维肿瘤球层面捕捉到化疗药物引发的线粒体代谢响应。

双光子光热（2PPT）显微镜工作原理与检测限

该研究由 Nathaniel Hai、Chinmayee Vallabh Prabhu Dessai、Dingcheng Sun、Jianpeng Ao、Pin-Tian Lyu、Yifan Zhu、Ji-Xin Cheng 完成，通讯作者为 Ji-Xin Cheng。论文题为 "Submicromolar imaging of intrinsic chromophores by two-photon photothermal microscopy captures mitochondrial response to chemotherapy"，于2026年7月发表于《Science Advances》。

重要发现
01双光子光热显微成像的原理与灵敏度
该研究的核心贡献在于建立了一种基于光热效应的无标记成像方法，用以替代传统的自发荧光检测。其基本原理是：目标发色团吸收泵浦光后进入激发态，大部分能量通过非辐射弛豫转化为局部热量，引起周围介质折射率的瞬态变化；另一束探测光经过该区域时，其波形因热透镜效应发生调制，通过锁相放大即可提取与发色团浓度成正比的光热信号。由于NADH 和 FAD 的荧光量子产率仅分别为 2% 至 4% 和 8% 至 10%，绝大多数激发能量最终以热的形式释放，因此光热检测在原理上可比荧光检测获得 10 至 20 倍的信号增强。

双光子光热（2PPT）显微镜工作原理与检测限

在系统实现上，该方法采用泵浦- 探测构型：可调谐近红外飞秒激光作为泵浦光用于双光子激发，固定波长 1045 纳米激光经倍频产生 522.5 纳米可见光作为探测光。两束光经二向色镜合束后，通过振镜扫描并由 60 倍、1.2 数值孔径水浸物镜聚焦于样品；透射光由 1.4 数值孔径油浸聚光镜收集，滤除泵浦光后仅保留探测光，送入单像素光电探测器与锁相放大系统。为优化信号采集，泵浦光经声光调制器以 125 千赫兹频率、5% 占空比进行调制，既规避了低频 1/f 激光噪声，又匹配了发色团 0.1 至 10 微秒的热弛豫时间尺度。

2PPT和2PAF对癌细胞线粒体NADH成像的比较

在无菌溶液中的灵敏度测试表明，双光子光热成像对NADH 的检测限达到 0.87 微摩尔，对 FAD 达到 0.99 微摩尔，均进入亚微摩尔区间。作为对照，相同条件下传统双光子自发荧光对 NADH 和 FAD 的检测限分别为 17.5 微摩尔和 11.6 微摩尔。光热方法对 NADH 的灵敏度提升约 20 倍，对 FAD 提升约 10 倍，这一倍数关系与两种辅酶各自的荧光量子产率高度吻合，验证了光热信号来源于非辐射热释放的核心假设。

02单细胞水平的线粒体代谢成像与光谱验证
研究人员将该方法应用于培养的SK-OV-3 卵巢癌细胞，在 720 纳米泵浦波长下靶向 NADH。成像结果显示，细胞质中的线粒体呈现出两种典型形态：与健康、高能量需求状态相关的管状或杆状线粒体，以及与细胞应激、衰老或死亡相关的椭圆或球状线粒体。光热成像能够清晰分辨单个线粒体，其信噪比达到 14.27 分贝，是同等条件下自发荧光的四倍以上。自发荧光虽能捕捉信号较强的椭圆状线粒体，但对管状线粒体的信号高度散射，难以识别单个细胞器，这一差异直接反映了两种方法在灵敏度上的差距。

2PPT显微镜捕捉SK-OV-3细胞对ROS抑制的代谢反应

2P显微镜通过NADH和FAD传感可视化饥饿SK-OV-3细胞中不同的线粒体形态

由于光热成像依赖局部热产生而非荧光发射，本身不具备分子特异性，研究人员通过光谱学方法验证了信号来源。他们在680 至 960 纳米范围内扫描泵浦波长，分别测量了 NADH、FAD 和细胞色素 C 三种标准溶液的光热光谱，并与活细胞内 20 个随机选取线粒体的光谱进行比对。结果显示，线粒体光谱在 750 纳米附近出现下降、在 770 至 820 纳米区间保持相对平稳，这一特征与 FAD 光谱高度吻合，而与细胞色素 C 在 750 至 760 纳米处的强信号峰截然不同。相量分析进一步确认，线粒体光谱与 FAD 最为接近，其次为 NADH，与细胞色素 C 相似度最低，从而证明在该实验条件下光热信号主要来源于代谢辅酶而非血红素蛋白。

03代谢扰动与化疗响应的实验验证
为验证该方法捕捉动态代谢变化的能力，研究人员设计了三组实验。第一组采用N - 乙酰半胱氨酸抑制活性氧生成，处理后细胞内 NADH 和 FAD 的中位信噪比分别下降 33% 和 37%，同时线粒体形态从以杆状为主转变为以椭圆状为主，反映了能量生成受阻后的结构重塑。

2PPT显微镜捕捉到化疗后肿瘤球体的代谢异质性

第二组为营养饥饿实验，分别在24 小时和 48 小时两个时间点观测。管状线粒体的 NADH 水平在 24 小时饥饿后显著升高，提示细胞启动保护性代谢适应以维持能量供给；至 48 小时则出现下降趋势，反映细胞转向能量节约状态。椭圆状线粒体的 NADH 和 FAD 在两个时间点均持续显著下降，表明这类功能受损的细胞器在应激条件下进一步丧失代谢活性。这一结果首次在无标记条件下区分了不同形态线粒体对营养胁迫的差异化代谢响应。

第三组将研究推进至三维肿瘤球模型。SK-OV-3 细胞形成直径约 500 微米的肿瘤球后，经顺铂化疗药物处理 4 小时。对 100 微米深度体积的最大振幅投影分析显示，化疗后 NADH 信号显著下降，而 FAD 信号显著上升，两种辅酶的反向变化反映了肿瘤细胞在药物压力下向氧化代谢表型的转变。这一发现与既往关于药物处理后癌细胞氧化还原重塑的报道一致，同时证明该方法能够在散射严重的三维生物样本中提取有意义的代谢信息。

创新与亮点
该研究突破了传统自发荧光成像因低量子产率导致的灵敏度瓶颈，将代谢辅酶NADH 和 FAD 的无标记检测限推进至亚微摩尔级别，分别较自发荧光提升约 20 倍和 10 倍。其提出的双光子光热技术通过探测双光子吸收后的热瞬态而非荧光发射，从根本上改变了对比度生成机制，同时保留了双光子激发固有的光学层切能力和三维成像兼容性。光谱学验证使其能够在无标记条件下判定信号的分子来源，弥补了光热方法本身缺乏分子特异性的缺陷。在实际应用中，该技术实现了单细胞内不同形态线粒体的代谢差异分辨，并在三维肿瘤球中捕捉到顺铂化疗引发的氧化还原重塑，为癌症代谢研究、药物疗效评估和耐药机制探索提供了高灵敏度、无标记的亚细胞级成像工具。

总结与展望
研究建立的双光子光热显微成像方法，以亚微摩尔灵敏度实现了对细胞内源性代谢辅酶的无标记检测，在单细胞和三维肿瘤球层面均验证了其捕捉代谢动态变化的能力，为生物医学光学成像提供了一种高灵敏度的新范式。未来可进一步优化检测参数、建立光热信号与绝对代谢物浓度的定量校准关系，并向活体模型和多模态融合方向拓展，推动该技术在肿瘤代谢诊断与疗效监测中的临床转化。

论文信息

声明：本文仅用作学术目的。

Nathaniel Hai et al. ,Submicromolar imaging of intrinsic chromophores by two-photon photothermal microscopy captures mitochondrial response to chemotherapy.Sci. Adv.12,eaee7678(2026).

doi:10.1126/sciadv.aee7678