生物组织内部三维结构的高分辨率成像是理解生命过程的重要手段，但组织中各组分折射率的不均一性导致光散射，内源性色素（如血红素）造成光吸收，使深层体积成像面临巨大障碍。现有组织透明方法耗时长达48 小时至 32 天，荧光探针扩散深度有限，难以实现全组织均匀标记。该研究提出一种名为 SoniC/S 的超声辅助组织透明与免疫荧光染色方法，将 40 kHz 低频超声与有机溶剂型组织透明试剂及 iDISCO 染色流程相结合，在小鼠胫骨前肌、大鼠跟腱和小鼠脾脏三种代表性组织中，仅用 36 小时即实现完全透明，15 小时完成深层均匀免疫标记，为生物医学体积成像提供了快速有效的新路径。

该研究由 Hoi Pan Harry Cheung、Marianne Lauwers、Zhengao Wang、Jianfeng Wang、Chengyun Ning、Dai Fei Elmer Ker 及 Dan Michelle Wang 共同完成，论文题为 "Rapid sonication-assisted whole tissue clearing and immunostaining"，在线发表于 Scientific Reports。

重要发现
01低频超声的安全性评估
在建立SoniC/S 方法之前，研究团队首先系统评估了 40 kHz 低频超声对组织形态和蛋白完整性的影响。实验选取三种具有不同光学和结构特性的组织作为模型：小鼠胫骨前肌代表软组织，大鼠跟腱代表致密胶原组织，小鼠脾脏代表富血红素组织。样品分别置于被动浸泡、温和振荡和低频超声三种条件下，在 0 至 168 小时的多个时间点采集数据。结果显示，超声组在 6 小时时的组织变形率与被动浸泡对照组无显著差异，跟腱、肌肉和脾脏分别为 4.74%、2.85% 和 3.45%。即使延长至 168 小时，超声组的变形率仍与对照组相当，且低于温和振荡组。蛋白损失分析同样表明，短时间超声处理下蛋白流失可忽略不计；168 小时后，跟腱蛋白损失仅为 0.75±0.23 µg/mg（约 0.075%），脾脏为 8.59±0.37 µg/mg（约 0.859%），均与被动浸泡组无统计学差异，且显著低于温和振荡组。这一结果证实 40 kHz、0.370 W/cm² 的低频超声在长达 7 天的处理中对组织结构和蛋白完整性影响极小，为其整合入组织透明流程奠定了安全基础。

低频超声促进分子渗透的物理机制在于空化效应与声孔效应的协同作用。超声在液体中引发气泡的快速形成与内爆，产生剧烈的局部压力波动，这种振动效应可暂时扰动细胞膜脂质双分子层，形成瞬时微孔，从而显著提高组织对小分子药物、蛋白质和DNA 等各类分子的通透性。研究团队正是基于这一原理，假设将低频超声引入组织透明和染色工作流，能够加速透明试剂渗透并增强荧光探针扩散。

在小鼠胫骨前肌中，即使最短的SoniClear-1 方案也达到了与 PEGASOS 相当的透明度，处理时间缩短 25 倍。随着时间延长，SoniClear-2、-3、-4 的透明度分别较 PEGASOS 提升 1.9 倍、2.1 倍和 2.3 倍。光透过率测量覆盖紫外 - 可见 - 近红外全波段（350 至 1000 nm），SoniClear-2 和 - 3 在多个特征波长均优于 PEGASOS：在 400 nm 处，PEGASOS 透过率为 19.03%，SoniClear-3 达 58.17%；在 600 nm 处分别为 76.56% 和 87.94%；在 1000 nm 处分别为 87.54% 和 91.81%。组织变形分析显示，除 SoniClear-3 和 - 4 外，其余方案的线性膨胀和变形率与 PBS 对照组无显著差异。

致密胶原组织的透明一直是领域难题，因为紧密排列的胶原纤维和高黏弹性严重阻碍试剂扩散。研究将SoniClear 应用于大鼠跟腱，宏观观察显示样品实现了全组织水平透明，透明度与 PEGASOS 相当。定量测量中，PEGASOS 透明度为 32.00 线对 / 毫米，SoniClear-4 达 44.33 线对 / 毫米。光透过率方面，所有 SoniClear 方案均优于 PEGASOS，其中 SoniClear-3 表现最佳：400 nm 处 76.45% 对比 62.85%，600 nm 处 86.08% 对比 65.52%，800 nm 处 86.85% 对比 66.95%，1000 nm 处 89.83% 对比 72.07%。除 SoniClear-4 外，各方案的线性膨胀均低于 PEGASOS 且与对照组相当。

针对富血红素的小鼠脾脏，SoniClear-2、-3、-4 的透明度分别较 PEGASOS 提升 1.47 倍、1.56 倍和 1.47 倍，同时处理时间分别缩短 8.33 倍、4.17 倍和 2.08 倍。SoniClear-3 在 1000 nm 处光透过率达 77.26%，显著高于 PEGASOS 的 52.75%。组织变形方面，SoniClear 各方案的变形率（19.13% 至 23.03%）均低于 PEGASOS 的 22.65%，其中 SoniClear-3 和 - 4 与对照组无显著差异。综合三种组织的表现，SoniClear-3（36 小时）在透明度、光透过率和形态保持之间取得了最佳平衡。

采用 SoniCStain 全组织免疫荧光染色方法对大鼠跟腱的成像深度与信号强度开展评估

以大鼠跟腱为模型，经SoniClear-3 透明后进行免疫染色，标记 I 型胶原和细胞核。光片显微镜成像结果显示，被动浸泡法虽能标记 1000 μm 厚度内的结构，但信号主要集中在组织周边。SoniCStain-1 已实现从表面到 1000 μm 深度更强且更均匀的核信号，但 I 型胶原信号仍有周边富集。延长处理时间后，SoniCStain-2、-3 和 - 4 均成功标记至 1000 μm 深度，在 500 μm 处可清晰分辨细胞核信号。定量荧光强度分析表明，SoniCStain-3 从表面到 1000 μm 深度的平均 Hoechst 信号为 5.4 任意单位，平均 I 型胶原信号为 5.4 任意单位；而被动浸泡法分别仅为 2.5 和 1.5 任意单位。这一结果明确证明 SoniCStain 能够在致密胶原组织中实现快速、均匀的深层免疫荧光标记。

创新与亮点
该研究突破了组织透明与免疫染色中长期存在的两大瓶颈：处理时间过长和荧光探针扩散深度不足。传统被动扩散方法耗时48 小时至 32 天，电场辅助法需 4 天且强电流可能损伤分子结构，灌注辅助法需 32 天且高压有组织损伤风险。SoniC/S 首次将 40 kHz 低频超声与有机溶剂型透明试剂及 iDISCO 染色整合，利用空化效应和声孔效应在不损伤组织的前提下加速分子渗透。SoniClear 仅需 36 小时即达到甚至超越商用试剂盒 150 小时的透明效果，光透过率在致密胶原组织中提升逾 20 个百分点；SoniCStain 将染色时间从 192 小时压缩至 15 小时，在 1000 μm 深度实现均匀标记，荧光强度提升 2 至 3 倍。该方法无需特殊设备或组织改性，适用于软组织、致密胶原组织和富色素组织，在肌肉骨骼疾病研究、肿瘤微环境三维解析和器官发育成像等场景中具有重要应用价值。

总结与展望
SoniC/S 方法通过低频超声辅助，在 36 小时内实现多种组织的高效透明，15 小时内完成深层均匀免疫染色，同时保持低组织变形和低蛋白损失，为全组织三维体积成像提供了快速可靠的解决方案。未来可进一步拓展至更多组织类型，探索多色荧光标记的兼容性，并系统优化超声频率与功率参数，以期进一步缩短处理时间并提升透明与染色效果。

doi:https://doi.org/10.1038/s41598-025-18928-5