单分子定位显微镜（single-molecule localization microscopy, SMLM）凭借出色的空间分辨率与单分子灵敏度得到广泛应用，但常规三维 SMLM 存在分辨率各向异性的问题：轴向分辨率通常比横向差2至3倍。4Pi-SMLM 这类干涉方法通过双物镜相干探测，把轴向定位精度提升约5倍，在全细胞范围内实现10至15纳米的各向同性三维分辨率。然而，仪器复杂、对准要求严苛与成本高昂，限制了它的推广。ROSE-Z 用单物镜激发干涉简化了这一架构，但仍依赖两条独立光路之间的双光束干涉，天然容易受热涨落、机械振动与漂移带来的相位不稳定影响。如何获得一种更易获取、更稳健的干涉方案，一直是该领域的现实需求。

 

2026年3月31日，西湖大学章永登团队在 Nature Biotechnology 在线发表题为“Mirror-enhanced 4Pi-SMLM with one objective enables isotropic nanoscale imaging”的研究论文，报道了一种镜面增强的 4Pi-SMLM（me4Pi-SMLM）方案：用单物镜配置，借助反射镜对激发光的回射产生相位可调的干涉条纹。

me4Pi-SMLM 去掉了常规 4Pi 架构中的上方光路，改为在样品上方放置一面反射镜，把激发光回射回来，直接在样品平面形成轴向驻波干涉图样。为实现精确的轴向定位，压电致动器在毫秒级时间内平移反射镜，以亚纳米精度移动干涉图样，依次采集三幅相位相差2π/3的图像。这种自参考的干涉方式使系统对机械振动具有较强的抵抗力，也不再需要专门的实时聚焦锁定模块。为解决周期性带来的歧义，研究团队用柱透镜引入轻微像散，用于粗略的轴向定位与可靠的相位解缠绕。

用一面反射镜替代第二个物镜
南模生物为该研究提供了Rosa26-GFP-OMP25小鼠。
标定结果显示，在552纳米激发下干涉周期为210纳米，调制深度约为0.9。在这些条件下，与常规三维 SMLM 相比，me4Pi-SMLM 的轴向定位精度提升约5倍，在约5300光子预算下，三个维度的定位精度均达到2至3纳米。

固定细胞中分辨微管、核孔复合物与内质网
由于me4Pi-SMLM 需要分子在三幅连续的相位图像中持续发光，研究团队采用 DNA 点累积纳米形貌成像（DNA-PAINT）以减轻荧光团光漂白带来的强度波动，并在慢速成像模式下以45毫秒的循环时间采集；标记上用纳米抗体替代常规抗体对，以缩小标记尺寸。

在COS-7 细胞的微管上，对发光达到或超过十帧的分子做定位分析，在约5500光子预算下得到2至3纳米的定位精度；由相邻帧定位间距估计的三维定位精度为2.6纳米，傅里叶环相关（Fourier ring correlation, FRC）分辨率在各维度均优于10纳米。在 U-2 OS 细胞的核孔复合物上，研究团队使用内源标记 Nup96 的纯合敲入细胞系，me4Pi-SMLM 同时分辨出核质环与胞质环，清晰度高于常规三维 SMLM；对500个核孔复合物做颗粒平均后，可观察到 Nup96 的近乎全部32个拷贝，质量与常规 4Pi-SMLM 或埃级精度的 MINSTED 相当。在结构平均图中，相邻两个 Nup96 蛋白在横向相距10纳米、轴向相距3纳米，对应优于10纳米的三维分辨率。对固定 COS-7 细胞的内质网成像则显示出由中空管道（直径60至100纳米）与片层结构相连而成的网络，片层厚度为30至50纳米，比内质网管道更薄，与 4Pi-SMLM 所得数值一致。

双色、全细胞、快速模式与活细胞成像
研究团队整合既有的挽救荧光方法实现双色成像，筛选出Alexa Fluor 568 与 ATTO Rho11 作为在552纳米激发下与 Cy3B 光谱兼容的染料。在共标微管与内质网的 COS-7 细胞中，两者光谱分离良好、串扰很小，可在横向与轴向上分辨内质网管道与微管各自的中空结构；改用对应纳米抗体分别标记内质网外膜（Sec61β）与内腔（KDEL）后，也能区分这两个空间上紧邻的区室。

所用物镜的景深约为1.2微米，超过该厚度的成像体积需要轴向扫描，研究团队通常以500纳米步长平移样品以保证相邻层之间有足够重叠。在小鼠精母细胞核中，针对支架蛋白 SYCP3 的免疫标记使 me4Pi-SMLM 分辨出整个细胞核内完成联会的染色体，无论其空间取向或深度如何，都能呈现联会复合体亚结构的双螺旋特征。在 HeLa 细胞中，对线粒体外膜的成像达到4.5微米深度，由七个光学切面重建出的体积能清晰分辨膜轮廓与复杂的互连结构，未见可察觉的鬼影伪迹；定量分析显示，在整个成像体积内相邻帧定位间距精度维持在3至5纳米，FRC 分辨率在各维度为10至15纳米。

分子需跨三帧持续发光这一要求，对依赖荧光团自身光物理性质的技术（如dSTORM）并不理想。为此，研究团队通过重新编排同步时序实现了快速成像模式。用结合动力学更快的荧光源性 DNA-PAINT 探针对固定 COS-7 细胞的微管成像时，循环时间为9毫秒，较慢速模式快5倍，FRC 分辨率约8纳米，微管中空结构的成像质量与慢速模式相当；以15毫秒循环时间对 Alexa Fluor 647 标记的线粒体成像同样可行。

此前，常规4Pi-SMLM 方案的活细胞成像尚未见报道。研究团队构建了稳定表达 Sec61β-Emerald-HaloTag 的 U-2 OS 细胞系，以活细胞兼容染料标记后，在共聚焦培养皿中以9毫秒循环时间记录了10分钟的内质网动态。在10秒的时间分辨率下，重建结果呈现出细胞外周的内质网管网络，并捕捉到管道生长以及两处多重连接点的融合与消失；测得的管道直径为60至70纳米，各维度 FRC 分辨率为40至60纳米。进一步做三维单分子跟踪时，30秒内的累积轨迹重建出内质网管网络，单条轨迹显示出不均一的分子迁移行为，各方向定位精度约为6至7纳米，限制比峰值在0.2，与 Sec61β 分子被限制在内质网膜内相符。

脑片深层成像：线粒体与ChR2 的三维分布
把超分辨成像拓展到组织样本，对常规4Pi-SMLM 尤其困难：它依赖单分子发射光子经两个相对物镜收集后的相干干涉，而组织中的折射率不均一与深度相关像差会破坏干涉所需的相位关系，既降低定位性能也限制成像深度。相比之下，me4Pi-SMLM 的探测配置等同于单物镜三维 SMLM，天然更适合组织成像。

研究团队在30微米厚的小鼠脑片中对多个深度的线粒体成像，观察到颗粒状、杆状与延长形等不同形态，随区域与深度而变化，与培养细胞中常见的延展管状网络明显不同。定量分析确认，相邻帧定位间距三维精度约6纳米、FRC 分辨率约12纳米，在约20微米的成像深度下均得以维持。随后，研究团队考察了光控离子通道、光遗传学调控所需的通道视紫红质2（channelrhodopsin 2, ChR2）的纳米尺度组织：30微米脑片成像显示 ChR2 沿轴突分布为离散的、与膜相关的簇，在轴突膜上表现为中空管状特征与团块状结构；在约6纳米的三维精度与优于15纳米的 FRC 分辨率下，重建出 ChR2 的三维分子组织。

综上所述，此研究发展的me4Pi-SMLM 在考虑生物样本中标记尺寸的前提下，于三个维度达到优于10纳米的分辨率，性能与 ROSE-Z 相当，也可比拟常规 4Pi-SMLM，而硬件复杂度与对准工作量大幅降低。研究提示，几乎任何现有的三维 SMLM 装置，只需加装一面反射镜与一个价格可接受的压电致动器即可升级为 me4Pi-SMLM。作为原理验证，此研究的组织成像深度限于约20微米，超过该深度后样品引起的光学像差会明显劣化图像质量；作者认为，把近年三维 SMLM 中基于算法与自适应光学的像差校正手段整合进来，有望把成像深度拓展至约50微米。

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