用近重直（小倾角10º）转头快速分离RNA

2008-12-30 来源:本站点击次数:2401

用近重直（小倾角10º）转头快速分离RNA

设备：

Hitachi CP 100 MX或Beckman L—100xp 超速离心机日立P90NT 或Beckman NT 90 转头，8×5ml ，密封管。

溶液：

A液：0.5％ SDS，20mM Sodium acetate

10mM EDTA (PH5.5)

B液：0.5％ Sodium N—lauroyl sarcosinate (N—月桂肌氨酸钠)

20mM Sodium acetate ,10mM EDTA (PH5.5)

C液：5.7M CsCl，0.1M EDTA (PH5.5)

离心顺序：

1．培养好的E.coli 600液，高速离心，50ml PP或PA管，9200 rpm×20分，4 ℃

2．每管沉淀加1ml A液，再加1ml phenol混匀，60℃，振荡器上摇5分钟

3．混匀后注入7ml PP或PA 离心管，每管试剂容量5—5.5 ml （日立R22A高速转头，18×7ml ，CR22G或CR21G或其他老型号离心机），9400 rpm , 4℃离心5分钟。

4．每管取出800ul 上清液加入2.5倍乙醇，再加入1.2 ml 溶液B，最终溶积为4 ml。

5．超速离心管（5PA密封管），每管先加2 ml 混合液，然后用注射器深入离心管底部，每管加入约3 ml 溶液C直到加满。

6．用日立STF2自动熔封管器封口后，放入P90NT 转头85,000rpm ，15℃，离心2小时，加速“5”，减速“7”

注：不可超过8.5万rpm，否则可能引起CsCl结晶。

7．离心后RNA沉淀在离心管底部，DNA在中下部溶液中。