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超速离心在基孔肯雅病毒疫苗研究中的应用

2025-08-19     来源:贝克曼库尔特     点击次数:135

近日，佛山市感染基孔肯雅热（CHIKV）的病例已经超过4000例，引起公众的极大关注。CHIKV主要依靠埃及伊蚊和白纹伊蚊叮咬传播，已经传染超过110个国家。世界卫生组织估计，自2005年基孔肯雅病毒重新出现以来，它已在全球造成超过200万例严重急性和慢性关节炎病例。


目前有两种CHIKV疫苗已用于几个国家的高危人群，但是尚未广泛使用，目前受到较高不良反应率和存储条件的限制。在暂无特效药的情况下，开发成熟可靠的疫苗对于疫情的防控仍然至关重要。

参考文献：
Chikungunya virus and other emerging arthritogenic alphaviruses

作为病毒纯化经典方法学的超速离心法，广泛应用于各种虫媒病毒的纯化（点击了解更多虫媒病毒的超离纯化方法：超速离心在虫媒病毒中的应用）。在CHIKV疫苗的研究工作中，超速离心仍然是主要的纯化方法之一。
纯化流程示意图
 
昆虫细胞系中CHIKV-VLP的纯化
  1. 通过向培养基组分中加入7%（w/v）聚乙二醇（PEG）-6000和0.5M NaCl，从培养基中沉淀VLP和其他蛋白质组分，并在4°C的滚筒台上孵育2小时。
  2. 在4°C下以4000×g离心沉淀15分钟，并将沉淀溶解在4°C的1ml GTNE缓冲液中。
  3. 在4°C的GTNE梯度中制备不连续的70%（w/v），40%（w/v）蔗糖梯度液。
  4. 小心地将1 ml VLP溶液加载到40%蔗糖部分的顶部，不要破坏梯度。
  5. 在4°C的超速离心机中以70,000×g离心2小时。
  6. 小心地分离40-70%蔗糖界面处的VLP条带并将其重悬于5 ml GTNE缓冲液中。
  7. 在4°C的超速离心机中以85,000×g离心30分钟沉淀VLP，重悬于50μl GTNE中，然后储存在-80°C以供后续分析和使用。
参考文献：
Production of Chikungunya Virus-Like Particles and Subunit Vaccines in Insect Cells
 
衣壳完全缺乏的CHIKV减毒活疫苗纯化
突变型（A）和野生型（B）CHIKV病毒粒子的密度梯度馏分组分qRT-PCR和特异性抗体蛋白质印迹测定结果
  1. 在30 hpi或96 hpi下，4°C，400×g离心10分钟和5,000×g离心20 min收集上清液。
  2. 0.22μm过滤器过滤，4°C下，以8%的终浓度聚乙二醇8000过夜沉淀上清液。
  3. 在4°C下以14,000×g离心1小时，使用移液器将沉淀轻轻重悬。
  4. 将悬浮液覆盖在20至60%线性蔗糖梯度上，并在Optima MAX-XP超速离心机中使用MLS-50转子在4°C下以34,000rpm超速离心3小时。
  5. 从梯度中回收病毒组分。从上到下收集10 个500 μl馏分。
参考文献：
Infectious Chikungunya Virus (CHIKV) with a Complete Capsid Deletion: a New Approach for a CHIKV Vaccine


硫酸纤维素色谱（Column）将病毒浓度提高100倍，然后在不连续的蔗糖梯度中进行超速离心（gradient）去除杂质，再通过考马斯染色检测病毒

两步法高度纯化EILV/CHIKV嵌合病毒
通过0.22 μm过滤器过滤培养基，室温下通过硫酸纤维素（AMSBIO）色谱柱。上样整个体积的培养基后，用PBS洗涤色谱柱，并在最小体积（1-1.5 ml）的7xPBS中洗脱病毒。立即将其加载到新鲜制备的蔗糖梯度（1.5 ml 50%、2 ml 40%和7 ml PBS制备的30%）的顶部，并以36,000 rpm、4°C离心3.5小时。收集一条清晰可见的条带，用PBS稀释，并将等分试样储存在-80°C。

已经上市的IXCHIQ疫苗生产也采用类似的层析+密度梯度超速离心的两步法进行纯化。

参考文献：
Optimized production and immunogenicity of an insect virus-based chikungunya virus candidate vaccine in cell culture and animal modelsChikungunya Virus Vaccines: A Review of IXCHIQ and PXVX0317 from Pre-Clinical Evaluation to Licensure
 
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