苗景赟    王奕军   (通用电气医疗集团 GE Life Sciences)

 

 

 

    在人类与各种疫病的长期斗争过程中，没有任何其它医疗措施能像疫苗一样对人类的健康产生如此重大影响，也没有任何其它的治疗药品能像疫苗一样以其低廉代价把某种疾病从地球上消灭^[1] 。

 

    近年国内外生物技术不断发展，出现多个年销售额超过10亿美元的重磅炸弹疫苗药物，如流感疫苗、肝炎疫苗、宫颈癌疫苗和肺炎多糖疫苗等。2008年到2010年全球疫苗年复合增长率超过14%，2009年全球疫苗总产值超过220亿美元，全球疫苗总产值在2012年预计将突破400亿美元^[2] 。国内疫苗市场在2009年也超过13亿美元，且以20%以上的速度复合增长，2009年SFDA疫苗批签发超过10亿剂量 ，病毒类疫苗约占60% ^[3] 。

 

    国内疫苗产业发展迅速，拥有近40家疫苗企业可以生产约50种疫苗药物，目前已建成年产超过1.6亿剂量的甲流疫苗生产线^[4] 。但与此同时，国内疫苗企业也面临着诸多严峻挑战：

 

     (1) 生产规模小，产能不足

    我国人口众多，人民群众对各种疫苗的需求增长迅速。而国内疫苗生产规模普遍较小，产能较低，难以满足疫苗规模化生产的需求。以狂犬灭活疫苗为例，国内部分厂家已经采用多个30L或14L小规模搅拌生物反应器结合微载体技术进行细胞培养平行放大代替转瓶工艺，但是多个反应器操作仍较繁琐，难以保证不同亚批产品的质量均一性，同时增加了工艺验证的难度。

 

    新型WAVE生物反应器结合微载体细胞培养技术和球转球放大工艺为贴壁细胞规模化培养和放大提供了可能性，使用较大规模的生物反应器可以显著降低工作强度，减少生产批次和过程控制，提高产能和快速响应能力。目前WAVE已经成功的用于细胞流感疫苗、脊髓灰质炎、昆虫细胞VLP 新型疫苗 (Novavax, Inc) 等；2005年，以新型天花疫苗和治疗性HIV 疫苗著称的丹麦Bavarian Nordic 公司将WAVE 1000 成功的用于新型MVA疫苗的GMP生产^[5] 。

 

    中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的现代膜分离技术，寿命长成本低、可以直接线性放大，满足疫苗的大规模生产纯化需要。

 

    (2) 疫苗质量亟需提高

    疫苗广泛使用于广大健康人群，因此对疫苗产品的安全性要求极高，国家药监部门也不断提高多种疫苗的质量控制标准，提高疫苗质量已经成为生产过程控制的关键。然而，国内部分疫苗仍采用较传统的生产工艺，如转瓶培养、绢布过滤、透析等，迫切需要引入新的现代生物技术对现有生产工艺进行改进。中空纤维膜分离技术提供更均一的膜孔径和低剪切力，通过对过程参数的优化和控制，不仅有利于保护病毒大分子的活性，还可以更好的去除各种杂质，提高产品质量，显著改善生产效率，成功的代替绢布过滤和透析等操作。

 

    (3) 对新技术需求迫切

    新技术不断涌现为疫苗的发展提供新的方向和发展趋势，如昆虫细胞/杆状病毒新型基因工程重组VLP疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗、联合疫苗、口服疫苗、治疗性疫苗和新型佐剂等逐渐成为研究热点。

 

    GE Life Sciences作为生物制药行业的领先者，和国内外知名制药公司/研究院所紧密合作，不断开发新的产品和应用，提供从上游大规模细胞培养、中空纤维切向流过滤、层析精细纯化以及 Biacore分析质控在内的病毒类疫苗整体解决方案^[6,7] 。

 

    2.1中空纤维膜过滤原理简介

    中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术（Tangential Flow Filtration, TFF）的范畴，又称错流过滤（Cross-Flow Filtration，CFF），其操作原理如图1：料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离^[8] 。

    和传统的平板膜包相比，中空纤维膜具有纤维管状的开放式流道结构(图 2)，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护大分子病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。

 

    中空纤维膜按孔径分为超滤膜和微滤膜，孔径齐全：超滤中空纤维膜(如750k)常用于蛋白质或病毒颗粒温和快速的浓缩；而微滤中空纤维膜( 如 0.45µm, 0.65um )可以直接用于培养液中细胞和细胞碎片的去除，实现层析柱前料液的澄清，省去离心过滤等预处理步骤。中空纤维膜具有良好的物理化学耐受性，超滤中空纤维膜入口耐压大于4bar，可以在50度下耐受1M NaOH/300ppm NaClO进行彻底清洗，大多数中空纤维膜还可以高压灭菌，寿命长，成本低^[9] 。

 

    中空纤维膜开放式流道解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集两大技术难题，提供了较温和的超滤方法以有效保护病毒颗粒的完整性，因此广泛应用于疫苗等生物制药和生命科学研究领域^[10] 。

 

    中空纤维750k超滤膜采用先进的膜加工制造工艺，具有均一的孔径分布，有效截留病毒的同时避免病毒在膜上的沉积，速度快收率高，同时较大的孔径使得DNA和杂蛋白等杂质透过而加以去除，降低浓缩后的料液黏度，提高产品质量^[16] 。

 

    美国默克公司将中空纤维过滤膜用于多种疫苗的生产，如使用300k中空纤维膜进行重组酵母乙肝疫苗的浓缩和洗滤，使用0.65µm 中空纤维膜澄清酵母裂解液生产HPV疫苗等[11]。 Bernd Kalbfuss 等人将750k中空纤维膜用于MDCK细胞流感病毒培养液的浓缩，发现中空纤维750k超滤膜可以有效去除宿主DNA等杂质^[12,13] 。C. Peixoto 等使用中空纤维750k浓缩轮状病毒的昆虫细胞培养液，优化后的浓缩收率达86%，浓缩的同时去除97%的DNA。最终得到高纯度的轮状病毒VLP类病毒颗粒, 工艺总收率37% ^[14] 。

 

    中空纤维化学稳定性极佳，寿命长，单位膜面积成本低，也广泛用于口蹄疫、狂犬等兽用病毒类疫苗的浓缩，改善产品质量。吕洪亮等在2009年成功的使用750k中空纤维进行兽用狂犬疫苗的浓缩，研究结果表明：相比100k和500k的超滤膜，750k中空纤维膜可以充分截留狂犬病毒，实现高抗原收率，同时有效去除牛血清白蛋白，提高疫苗的安全性、有效性和稳定性。最终成功建立了Cytodex 1微载体细胞培养、中空纤维750k浓缩、Sepharose 6FF层析纯化的高质量兽用狂犬疫苗生产新工艺 ^[15] 。目前采用此工艺的纯化兽用灭活狂犬疫苗已经获得新兽药证书正式投产。

 

    3.中空纤维浓缩病毒培养液实例

    相对于其他杂蛋白和DNA等杂质，病毒颗粒具有较大的分子量，因而可以使用超滤膜过滤和分子筛等技术按照分子量大小进行分离分级，建立通用的病毒纯化工艺。病毒类疫苗通常使用微载体细胞培养技术进行病毒培养，一定滴度的病毒培养收获液通过 1-2um玻璃纤维GF澄清过滤去除细胞碎片和部分 DNA，超滤膜浓缩 10-80倍，经灭活水解之后使用 Sepharose 4FF或 6FF分子筛层析按照分子量大小进行精细纯化^[16] 。

图 3 通用的病毒疫苗生产工艺

    病毒超滤浓缩通常使用 100-300k膜包，膜包筛网剪切力易造成病毒颗粒聚集和表面蛋白的脱落，从而影响病毒活性收率，因此对操作要求极高；此外，膜包筛网剪切力还容易加速杂蛋白的聚集（如牛血清白蛋白，卵清蛋白等），而100-300k较小的膜包孔径不利于浓缩过程中杂蛋白透过，因此浓缩液杂蛋白含量在浓缩过程中不断增加，蛋白凝胶层显著影响浓缩处理速度，较高的黏度也不利于后期4FF分离纯化和填料寿命。

 

    狂犬病毒属于弹状病毒科，病毒包膜的次突上的糖蛋白G是唯一暴露于病毒外部的病毒蛋白，是诱发细胞与体液免疫的主要抗原物质^[17] 。超滤浓缩过程中需要尽量温和以避免G蛋白的脱落，保护病毒的免疫原性，同时尽可能去除杂蛋白和 DNA片断。

 

    3.1.1 实验条件

样品：澄清病毒收获液 (CTN株，Vero细胞 Cytodex 1微载体连续 培养，Lot20090401)

实验设备：Quixstand 中空纤维卫生级超滤系统（可整体高压灭菌）

 AKTA Purifier10 层析仪

中空纤维超滤柱：UFP-750-E-4x2MA_0.085m2  (750kDa MWCO，GE)

Cassette 300k膜包0.1m2（某进口品牌）

检测方法：LD50病毒滴度(药典2010)，Elisa，Sepharose 4FF 16/40分析柱，目测外观

 

    3.1.2 实验结果

    我们分别使用中空纤维 750k超滤柱(GE)和 300k超滤膜包(某进口品牌) 进行狂犬病毒收获液的浓缩，考察处理速度、病毒颗粒收率和浓缩液澄清度等指标。除病毒滴度外，浓缩液使用Sephorase 4FF 16/40分子筛分析柱进行分析，快速检测比较杂质残留。

 

表1狂犬病毒培养液超滤浓缩实验条件

    使用 750k中空纤维和 300k膜包浓缩过程的通量-透过体积曲线见下图(Flux-Permeate Vol)。使用中空纤维 750k超滤柱进行狂犬病毒培养液浓缩，浓缩 20倍然后滤洗 3倍，整个过程需要 1小时 16分，平均处理通量 61 L/m2/hr (LMH)。使用膜包300k进行浓缩，浓缩20倍然后滤洗3倍，整个过程历时 1小时 20分，平均处理通量 49 LMH。

 

    使用 Sepharose 4FF分子筛分析柱对浓缩液进行分析，快速检定浓缩液中杂质的残留，并比较病毒和杂质的分离情况，结果见图 5所示。

 

    使用两种不同的超滤膜进行浓缩，所得浓缩液中病毒颗粒的积分面积相当，因此 750k中空纤维和 300k膜包都可以很好的截留病毒颗粒；然而，中空纤维 750k的浓缩液中小分子面积较小，表明 750k中空纤维可以使更多的小分子杂蛋白/核酸等杂质透过加以去除，在浓缩的同时提高产品的纯度，这一点也直观的表现在 750k所得病毒浓缩液外观更加澄清、黏度较低。

    中空纤维 750k具有更大的平均膜孔径，滤膜阻力较小，有利于杂蛋白的透过，浓缩过程中可以缓解高浓度杂蛋白引起的膜表面凝胶层，因此具有更快的处理速度，其平均透过通量可达61 LMH，比 300k膜包快 24%。这意味着选用同样膜面积，中空纤维膜的超滤浓缩时间将显著缩短，有利于保护病毒颗粒的稳定性，提高生产效率。

 

    从上下游工艺综合考虑，通过对层析前杂质的有效去除，所得浓缩液杂蛋白含量少，黏度低，有利于降低后期4FF分子筛层析纯化的负担，改善分子筛的分辨率，并且降低层析柱堵塞风险，延长填料使用寿命，整个工艺具有更好的经济性。

 

    3.2 流感病毒尿囊液的浓缩

    流感病毒属于正粘病毒科，分为甲乙丙三型，病毒包膜含有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，血凝抑制抗体为中和抗体，诱发机体免疫保护作用^[17] 。

 

    2007年世界首个细胞流感疫苗 Optaflu(诺华)经欧盟批准已经成功上市^[18] ，但由于细胞规模化培养技术和毒株适应等诸多问题，目前国内流感疫苗的生产仍使用传统鸡胚培养方式。鸡胚中含有大量的卵清蛋白等杂质，残留的卵清蛋白对人体会产生副反应。近年来SFDA不断提高疫苗制品中卵清蛋白的残留标准以保证疫苗的安全：卵清蛋白小于500ng/ml, 总蛋白小于HA 含量的4.5倍等 ^[19] 。

 

    作为层析分离前的重要的预处理步骤，超滤浓缩需要尽量温和以保护病毒的免疫原性，同时防止卵清蛋白的聚集以尽可能的将其透过去除，确保整个工艺的杂质去除能力。

 

    3.2.1 实验条件

病毒培养液：甲I型流感病毒尿囊液(Lot20080512)，0.8um澄清

实验设备： Quixstand 中空纤维卫生级超滤系统

中空纤维超滤柱：UFP-750-C-4MA_0.065m2 (750kDa MWCO)

                UFP-500-E-4MA_0.042m2  (750kDa MWCO)

                Cassette 300k膜包0.1m2 （某进口品牌）

                Cassette 500k膜包0.1m2（某进口品牌）

检测方法： HA血凝滴度，Lowry总蛋白，目测外观

 

    3.2.2 实验结果

    我们分别使用中空纤维 750k和500k超滤柱(GE)、300k和500k超滤膜包(分别来自于两家进口品牌) 进行流感病毒尿囊液的浓缩洗滤，考察处理速度、病毒 HA收率、总蛋白和浓缩液澄清度等指标。

使用中空纤维和膜包进行浓缩，均采用先浓缩后洗滤的策略，先浓缩20倍即开始滤洗5倍，然后继续浓缩至50x左右。这样可以避免高浓度卵清蛋白聚集，提高卵清蛋白的透过去除效率，提高产品质量。

 

    3.2.3 分析讨论

    我们比较了上述不同孔径的中空纤维膜和超滤膜包对流感病毒尿囊液的浓缩性能：

 

使用中空纤维膜和超滤膜包进行流感病毒尿囊液浓缩，除 500k膜包在透过端有HA血凝滴度检出外，其余三种膜均无漏过，HA收率令人满意。中空纤维750k 滤膜平均处理速度为 35LMH，比 300k膜包快60%以上。

 

    中空纤维 750k和中空纤维 500k相比，750k 滤膜使用切向流速相对较低，可以在保证病毒稳定性的基础上，适当提高切向流速，进一步提高处理速度。

 

    所得尿囊浓缩液中，单位血凝价的总蛋白(TP/HA)可以用于快速直观的表征浓缩液中的杂蛋白残留量。单位血凝价的总蛋白含量越低，说明浓缩过程的杂蛋白透过去除更彻底，所得浓缩液病毒相对纯度越高。由上表的数据可见，500k和 750k中空纤维进行浓缩，杂蛋白的含量均低于 300k 膜包，其中 500k中空纤维膜单位血凝价的总蛋白比 300k膜包低7%，750k中空纤维单位血凝价的总蛋白比 300k膜包低 1倍以上，中间产物质量显著得到改善。

 

 

    将不同孔径中空纤维滤膜所得尿囊浓缩液外观进行比较 (如图6)：中空纤维750k颜色浅白，黏度低，卵清蛋白去除较为彻底；而500k中空纤维膜仍为浅黄色，去除效果稍差。相比传统 300k膜包而言，中空纤维显著改进了浓缩液中间产物质量，有利于减轻后期4FF层析纯化的负荷，保证整体工艺的可靠性。

    在此基础上，我们下一步将使用中空纤维750k滤膜对不同型流感尿囊液的滤洗时机、滤洗缓冲液组成、切向流速和压力等参数进行深入优化，避免卵清蛋白聚集，进一步提高卵白去除效率。

 

    本文的研究结果表明：

    中空纤维 750k超滤膜成功的用于狂犬病毒收获液的浓缩和洗滤，膜处理量大于 70L/m2，平均处理速度达 61 LMH，处理时间仅 1.2小时，病毒收率近 100%，浓缩后产品外观澄清度好，病毒纯度 22% (面积归一化法)，比膜包提高 7%。中空纤维750k超滤膜成功的用于流感病毒尿囊液的浓缩和洗滤，膜处理量大于 90L/m2，平均处理速度达 35 LMH，处理时间小于 4小时，HA血凝滴度收率 95% 以上，浓缩后产品外观颜色浅白，澄清度好，单位血凝价的总蛋白(TP/HA)比300k膜包降低一倍以上。

 

    中空纤维膜具有开放式流道，解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集两大技术难题，提供了较温和的超滤方法，因此非常适合病毒类疫苗的工艺开发和规模生产。

 

    不同来源的滤膜由于加工制造工艺和质控标准不同，因此滤膜标称孔径和实际孔径大小分布存在一定的差异，需要在工艺优化过程中对不同来源不同孔径的滤膜进行比较和优化。膜孔径直接决定了浓缩的效率和产品质量。一方面需要选择膜孔径能够使目标分子有效截留以保证收率，另一方面要充分考虑杂蛋白的去除效果和处理速度。因此最佳的原则为：选择可以截留目标分子的孔径最大的膜，并且尽量选择孔径分布均一的滤膜。如相对较大孔径的中空纤维 750k膜具有均一的孔径分布，可以充分截留病毒颗粒，同时有利于DNA片断和 BSA等杂蛋白透过，实现病毒颗粒的温和浓缩和有效纯化。浓缩过程中杂质的有效去除，一定程度上避免了杂蛋白的累积，有利于防止膜表面蛋白凝胶层的形成，从而具有更快的处理速度，缩短工艺时间。

 

    本文成功的将中空纤维 750k超滤膜用于狂犬疫苗和鸡胚流感疫苗的温和浓缩和纯化。结果表明中空纤维 750k温和的超滤浓缩操作简单，有利于保持病毒颗粒的活性以实现高病毒收率，同时更好的去除杂蛋白等杂质，浓缩液黏度低澄清度好，有利于提高后期层析分离度，延长 4FF填料的寿命。

 

    日益突出的疫苗安全性问题要求疫苗生产企业对生产工艺过程和工艺参数严格控制，需要将上下游工艺综合考虑，在维持上游培养工艺稳定的基础上，尽可能提高每一步单元操作的杂质去除效率，保证最终的产品质量。

    使用中空纤维750k超滤膜，通过对层析前部分杂质的有效去除，所得浓缩液杂蛋白含量少，黏度低，有利于降低后期 4FF分子筛层析纯化的负担，改善分子筛的分辨率，并且降低层析柱堵塞风险，延长填料使用寿命，整个工艺具有更好的经济性。

 

    中空纤维膜过滤技术还具有温和低剪切力、不易堵塞、操作灵活、寿命长成本低、易于放大等优点，因此广泛应用于疫苗、单抗等生物制药和生命科学研究领域。本文的实验结果表明，中空纤维膜过滤技术可以成功的用于狂犬疫苗和流感疫苗的浓缩和生产，有利于改进疫苗产品质量、提高生产效率，降低生产成本。

 

图7 中空纤维过滤系统用于大规模疫苗生产

 

    基于中空纤维膜过滤技术的上述优点，国外已成功建立了用于处理大规模病毒培养液的中空纤维系统（图 7），如口蹄疫病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗、细菌类毒素疫苗等。国内多家知名人用和兽用疫苗企业也开始使用和建立大规模中空纤维系统进行疫苗的生产，国内最大规模的中空纤维系统已经达到 400平米，运行良好。

目前，中空纤维膜过滤技术已越来越广泛的用于疫苗、抗体和其他生物药物的生产，有助于推动整个生物制药产业的技术进步和发展！

 

1, 沈心亮；中国疫苗应用现状与发展趋势；新一代生物技术药物国际论坛，2002 年 10 月15 日，北京

2, Kalorama Information: http://www.kaloramainformation.com

3, Report: The study reviews, analyzes and projects the global market for Biopharmaceuticals for the period 2006‐2015, Industry Expert, 2010 April

4, 机遇与责任并重甲流疫苗市场商机无限，中国高新技术产业导报，2009/7/13

5, WAVE细胞培养手册，GE Life Sciences, 2010

6, Estmer Nilsson C. et al. A novel assay for influenza virus quantification using surface plasmon resonance. Vaccine 28, 759–766 (2010)

7, Andersson, E. Optimization of method for analysis of host cell proteins from Madine-Darby Canine Kidney and Chinese Hamster Ovary cells- using Biacore, MSc thesis, Uppsala University 2009

8, 苗景赟等，中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用，GE Healthcare，2009

9, 中空纤维操作手册，GE Life Sciences

10, 罗亮，纯化病毒疫苗的通用方法，GE Healthcare, 2004

11, James C. Cook et al, Purification of Virus-like Particles of Recombinant Human Papillomavirus Type 11 Major Capsid Protein L1 from Saccharomyces cerevisiae, Protein Expression and Purification, 17, 477~484 (1999)

12, Bernd Kalbfuss et al, Harvesting and Concentration of Human Influenza A Virus Produced in Serum-Free Mammalian Cell Culture for the Production of Vaccines，Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No. 1, May 1, 2007；   

13, Bernd Kalbfuss et al, Purification of Cell Culture-Derived Human Influenza A Virus by Size-Exclusion and Anion-Exchange Chromatography, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 96, No. 5, April 1, 2007

14, C. Peixoto, et al, Downstream processing of triple layered rotavirus like particles, Journal of Biotechnology 127 (2007) 452–461

15, 吕洪亮等，兽用灭活纯化狂犬疫苗生产工艺的优化，中国生物制品学杂志，Vol 22, No.9, 2009

16, 罗亮，疫苗生产纯化，GE Healthcare, 2004

17, 赵铠等，医学生物制品学，第二版

18, http://www.ebiotrade.com/newsf/2007-6/2007617155643.htm，生物通网站，2007年 6月

19, 中国人民共和国药典三部，2010版