基于CERO生物反应器的人类干细胞规模悬浮扩增方法介绍
2025-08-11 来源:本站 点击次数:127
本文介绍了一种可重复且多功能的人类多能干细胞（hPSC）动态悬浮扩增系统，通过OLS CERO台式细胞生物反应器，将 hPSC 以未分化聚集物形式培养。研究表明，在mTeSR 或 E8 培养基中进行 10 代长期扩增后，hPSC 仍保持正常核型、三胚层分化潜能及多能性标志物的高表达。该系统支持低至0.3×10⁵ cells/mL 的接种密度，提供了简化、经济且省时的中规模 hPSC 制备方法，对推进基于 hiPSC 的医学研究中的细胞制造具有重要意义。
CERO 3D细胞（类器官)生物反应器
CERO 3D细胞（类器官)生物反应器
1. 研究背景
随着人类诱导多能干细胞（hiPSC）在疾病建模、药物筛选等领域的应用，亟需标准化、自动化、低成本的 hPSC 扩增技术。
现有生物反应器多适用于大规模生产，存在体积大、需大量培养基、操作复杂、依赖专业人员等问题，难以满足多患者特异性 hiPSC 系的平行小规模扩增需求。
因此，研究旨在开发一种适用于中规模、平行化、简单高效的 hPSC 悬浮扩增系统。
2. 材料与方法
细胞类型：
人诱导多能干细胞（hiPSC）：iLB-C-31f-r1（源自真皮成纤维细胞）
人胚胎干细胞（hESC）：H9
培养系统：
OLS CERO台式细胞生物反应器：含 4 个 50mL 一次性培养容器，具备温度控制（37℃）、CO₂浓度控制、旋转搅拌（维持聚集物悬浮及营养供应），参数可通过触摸屏设置并保存。
培养方案：
接种：从 2D 培养收获单细胞，以 0.33-2.0×10⁵ cells/mL 密度接种至 10mL 培养基（含 10μM ROCK 抑制剂）。
培养：每日添加 5mL 培养基（mTeSR 培养 4 天，E8 需缩短周期），通过调整旋转速度控制聚集物大小。
传代：聚集物沉降后离心，经 Accutase 处理为单细胞，重新接种。
检测方法：
多能性验证：免疫荧光（检测 Oct-4、Nanog、Tra1-60 等）、流式细胞术（Tra1-60 表达）。
分化潜能：三胚层分化实验（检测 AFP、SMA、TUBB3 等标志物）、TaqMan® hPSC Scorecard™ Panel。
基因组稳定性：SNP 芯片分析。
代谢分析：葡萄糖和乳酸浓度检测（YSI 2700 分析仪）。
3. 研究结果
3D 悬浮培养体系的建立：
在 mTeSR 中，以 7.5×10⁴ cells/mL 接种时，4 天内扩增倍数达 4.9±2.1，Tra1-60 表达 > 90%。
形成均一圆形聚集物，平均直径 140±36μm（mTeSR）、138±24μm（E8）。
长期扩增能力（10 代）：
扩增率：hESC 为 5.42±2.87，hiPSC 为 5.09±3.20（mTeSR）；E8 中 hESC 扩增率 7.1±3.4，与 mTeSR 无显著差异。
多能性维持：持续高表达 Tra1-60（>90%）、Oct-4、Nanog，无分化标志物表达。
基因组与分化潜能：SNP 分析证实核型稳定，三胚层分化实验及 Scorecard 检测显示分化能力未受影响。
mTeSR 与 E8 培养基对比（如下表）：
2D 与 3D 培养转换：hPSC 在 2D 与 3D 培养间切换后，仍保持典型克隆形态及高表达多能性标志物（Tra1-60>90%）。
4. 讨论与意义
该系统解决了现有技术的痛点，实现了 hPSC 的中规模、平行化、低成本扩增，操作简单且无需专业培训。
支持从低接种密度起始，且能长期维持 hPSC 的多能性和基因组稳定性，适用于 hiPSC 生物银行建设和疾病建模。
兼容 mTeSR（ undefined ）和 E8（化学定义、无血清）两种培养基，其中 E8 的应用为临床级细胞生产提供了可能。
2D 与 3D 培养的无缝转换便于整合下游 2D 分化实验，拓展了其在基础研究和应用中的实用性。
关键问题：
该 hPSC 悬浮扩增系统相比传统培养方法有哪些核心优势？
答：核心优势包括：①操作简化：使用 OLS CERO台式反应器，无需复杂设备或专业培训，支持 4 个样本平行培养；②成本与效率：可从低至 0.3×10⁵ cells/mL 的密度起始，每日仅需添加培养基（无需 80% 换液），降低试剂消耗和操作时间；③稳定性：10 代扩增后仍保持正常核型、三胚层分化潜能及多能性；④灵活性：支持 2D 与 3D 培养无缝转换，兼容 mTeSR 和 E8 两种培养基。
mTeSR 和 E8 培养基在该系统中应用时的主要差异是什么？
答：主要差异体现在培养周期和代谢动力学：①培养周期：mTeSR 可维持 4 天培养，Tra1-60 表达仍 > 90%；E8 中 Tra1-60 表达在第 3 天达高峰（88.4±1.7%），第 4 天显著下降（61.8±29.3%），需缩短培养周期；②代谢：mTeSR 中葡萄糖消耗和乳酸产生从第 4 天骤升，E8 则从第 3 天开始；③扩增倍数：低接种密度下，mTeSR 最大扩增 20 倍，E8 为 14 倍，但两者长期平均扩增率无显著差异。
该系统对基于 hiPSC 的医学研究有何推动作用？
答：①标准化细胞制造：提供可重复的扩增方法，减少批次差异，利于多中心研究数据比对；②支持大规模生物银行：可平行扩增多患者特异性 hiPSC 系，满足疾病建模中对大样本量的需求；③临床转化潜力：兼容化学定义的 E8 培养基，符合临床级细胞生产要求，为细胞替代疗法提供高质量细胞来源；④简化实验流程：2D 与 3D 的无缝转换便于整合下游分化实验，加速药物筛选和疾病机制研究。
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随着人类诱导多能干细胞（hiPSC）在疾病建模、药物筛选等领域的应用，亟需标准化、自动化、低成本的 hPSC 扩增技术。
现有生物反应器多适用于大规模生产，存在体积大、需大量培养基、操作复杂、依赖专业人员等问题，难以满足多患者特异性 hiPSC 系的平行小规模扩增需求。
因此，研究旨在开发一种适用于中规模、平行化、简单高效的 hPSC 悬浮扩增系统。
2. 材料与方法
细胞类型：
人诱导多能干细胞（hiPSC）：iLB-C-31f-r1（源自真皮成纤维细胞）
人胚胎干细胞（hESC）：H9
培养系统：
OLS CERO台式细胞生物反应器：含 4 个 50mL 一次性培养容器，具备温度控制（37℃）、CO₂浓度控制、旋转搅拌（维持聚集物悬浮及营养供应），参数可通过触摸屏设置并保存。
培养方案：
接种：从 2D 培养收获单细胞，以 0.33-2.0×10⁵ cells/mL 密度接种至 10mL 培养基（含 10μM ROCK 抑制剂）。
培养：每日添加 5mL 培养基（mTeSR 培养 4 天，E8 需缩短周期），通过调整旋转速度控制聚集物大小。
传代：聚集物沉降后离心，经 Accutase 处理为单细胞，重新接种。
检测方法：
多能性验证：免疫荧光（检测 Oct-4、Nanog、Tra1-60 等）、流式细胞术（Tra1-60 表达）。
分化潜能：三胚层分化实验（检测 AFP、SMA、TUBB3 等标志物）、TaqMan® hPSC Scorecard™ Panel。
基因组稳定性：SNP 芯片分析。
代谢分析：葡萄糖和乳酸浓度检测（YSI 2700 分析仪）。
3. 研究结果
3D 悬浮培养体系的建立：
在 mTeSR 中，以 7.5×10⁴ cells/mL 接种时，4 天内扩增倍数达 4.9±2.1，Tra1-60 表达 > 90%。
形成均一圆形聚集物，平均直径 140±36μm（mTeSR）、138±24μm（E8）。
长期扩增能力（10 代）：
扩增率：hESC 为 5.42±2.87，hiPSC 为 5.09±3.20（mTeSR）；E8 中 hESC 扩增率 7.1±3.4，与 mTeSR 无显著差异。
多能性维持：持续高表达 Tra1-60（>90%）、Oct-4、Nanog，无分化标志物表达。
基因组与分化潜能：SNP 分析证实核型稳定，三胚层分化实验及 Scorecard 检测显示分化能力未受影响。
mTeSR 与 E8 培养基对比（如下表）：
| 指标 | mTeSR 培养基 | E8 培养基 |
| 最大扩增倍数 | 低接种密度下可达 20 倍 | 低接种密度下可达 14 倍 |
| Tra1-60 表达高峰 | 第 4 天（>90%） | 第 3 天（88.4±1.7%），第 4 天降至 61.8±29.3% |
| 代谢特点 | 第 4 天起葡萄糖骤降、乳酸骤升 | 第 3 天起葡萄糖骤降、乳酸骤升 |
| 培养周期 | 4 天 | 需缩短（建议 3 天） |
| 聚集物大小 | 140±36μm | 138±24μm |
2D 与 3D 培养转换：hPSC 在 2D 与 3D 培养间切换后，仍保持典型克隆形态及高表达多能性标志物（Tra1-60>90%）。
4. 讨论与意义
该系统解决了现有技术的痛点，实现了 hPSC 的中规模、平行化、低成本扩增，操作简单且无需专业培训。
支持从低接种密度起始，且能长期维持 hPSC 的多能性和基因组稳定性，适用于 hiPSC 生物银行建设和疾病建模。
兼容 mTeSR（ undefined ）和 E8（化学定义、无血清）两种培养基，其中 E8 的应用为临床级细胞生产提供了可能。
2D 与 3D 培养的无缝转换便于整合下游 2D 分化实验，拓展了其在基础研究和应用中的实用性。
关键问题：
该 hPSC 悬浮扩增系统相比传统培养方法有哪些核心优势？
答：核心优势包括：①操作简化：使用 OLS CERO台式反应器，无需复杂设备或专业培训，支持 4 个样本平行培养；②成本与效率：可从低至 0.3×10⁵ cells/mL 的密度起始，每日仅需添加培养基（无需 80% 换液），降低试剂消耗和操作时间；③稳定性：10 代扩增后仍保持正常核型、三胚层分化潜能及多能性；④灵活性：支持 2D 与 3D 培养无缝转换，兼容 mTeSR 和 E8 两种培养基。
mTeSR 和 E8 培养基在该系统中应用时的主要差异是什么？
答：主要差异体现在培养周期和代谢动力学：①培养周期：mTeSR 可维持 4 天培养，Tra1-60 表达仍 > 90%；E8 中 Tra1-60 表达在第 3 天达高峰（88.4±1.7%），第 4 天显著下降（61.8±29.3%），需缩短培养周期；②代谢：mTeSR 中葡萄糖消耗和乳酸产生从第 4 天骤升，E8 则从第 3 天开始；③扩增倍数：低接种密度下，mTeSR 最大扩增 20 倍，E8 为 14 倍，但两者长期平均扩增率无显著差异。
该系统对基于 hiPSC 的医学研究有何推动作用？
答：①标准化细胞制造：提供可重复的扩增方法，减少批次差异，利于多中心研究数据比对；②支持大规模生物银行：可平行扩增多患者特异性 hiPSC 系，满足疾病建模中对大样本量的需求；③临床转化潜力：兼容化学定义的 E8 培养基，符合临床级细胞生产要求，为细胞替代疗法提供高质量细胞来源；④简化实验流程：2D 与 3D 的无缝转换便于整合下游分化实验，加速药物筛选和疾病机制研究。
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