简介

用荧光方法定量细胞增殖可以简单快速的检测药物或其他实验处理方法对细胞生长的影响。Life Technologies公司的CyQUANT细胞增殖试剂盒是一个敏感性高、可重复并且简便的做荧光微孔板检测的方法。CyQUANT的GR染料可标记到细胞核上，通过荧光来计算细胞个数。DNA与RNA的比例会随着细胞周期的变化而改变，因此，CyQUANT试剂盒可以通过RNA酶溶解产物和核酸量做标准曲线。

本应用介绍了如何应用CyQUANT试剂盒和Molecular Devices公司的SpectraMax微孔板检测系统及SoftMax® Pro软件检测细胞增殖。文中共介绍了两种方法，一种是基于细胞的方法，另一种是将细胞样品用RNA酶溶解后做DNA标准曲线。

优势

- Rapid and convenient quantitation of cell growth
- Sensitive detection of as few as 50 cells
- Easy data analysis with preconfigured SoftMax Pro Software protocol

材料

- CyQUANT 细胞增殖试剂盒 (Life Technologies cat. # C7026)：Component A，400X CyQUANT GR 染料； component B，20X细胞溶解液； component ，100 μL浓度为 100 μg/mL的λ DNA 标准样品溶液
注意： 细胞溶解液和染料稀释后需在几小时内使用，CyQUANT GR染料溶液需避光保存。
- 细胞系： CHO-K1 细胞(ATCC # CCL-61)
- EDTA溶液(Fisher Chemicals cat. # S311-100)
- NaCl 溶液(Fisher Chemicals cat. # S271-500)
- 无DNA酶的RNA酶A或RNA酶混合液(Ambion cat. # 2286)
- 黑色底透96孔板(Corning cat. # 3603)
- 具有荧光检测模块的SpectraMax微孔板读板机 (Molecular Devices)

细胞准备

CyQUANT实验的贴壁或不贴壁细胞可以直接在微孔板中培养细胞然后冷冻，或者在培养皿中培养细胞，然后冷冻细胞样品转移动微孔板中。详细步骤可参考CyQUANT细胞增殖试剂盒产品说明书MP-7026。

基于细胞的CyQUANT实验法

准备细胞

步骤1：用胰酶或EDTA溶液将贴壁细胞消化下来，用培养基将细胞悬液按表中浓度稀释后放入96孔板，对照组为不含细胞的培养基。
步骤2：将孔板置于37℃环境下直到检测增殖的时间。孵育时间取决于细胞类型、增殖检测类型及实验目的。
步骤3：吸出孔中的细胞培养液，用PBS清洗一次，若细胞贴壁不牢可不洗。
步骤4：将孔板置于-70℃冷冻细胞直到检测(至少一小时，长可达数周)。冷冻步骤有利于细胞样品的完全裂解。

制备细胞样品做标准曲线

注意：最好使用与实验中使用的标准曲线相同类型的细胞类型。

步骤1：用胰酶或EDTA溶液将贴壁细胞消化下来，用培养基将细胞悬液稀释至105-106cells/mL。
步骤2：取1mL细胞悬液200g(约1,500rpm)离心5分钟，弃掉上清，将管底离出细胞置于-70℃冷冻直到检测。冷冻步骤有利于细胞样品的完全裂解。

准备试剂

步骤1：制备1X细胞裂解液，用蒸馏水以1:20稀释细胞裂解液储存液，需制备每孔200μL。
步骤2：制备1X CyQUANT GR染液/细胞裂解液，用1X细胞裂解液以1:400稀释CyQUANT GR染液储存液。稀释液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。

制备基于细胞法的标准曲线和样品

步骤1：将之前冷冻的离出细胞放在室温几分钟解冻。加入1mLCyQUANTGR染液/细胞裂解液，涡旋使细胞重悬。假设细胞为106个，细胞裂解液相当于106cells/mL。
步骤2：在孔板中以1:2的稀释梯度放入细胞悬液，最高为50,000cells/mL，最低为24cells/mL。加入CyQUANTGR染液/细胞裂解液使每孔液体终体积为200μl。每个浓度四个重复，并在空余孔中设几个对照组(无细胞)。
步骤3：将微孔板避光放置于室温2-5分钟。

设置仪器和软件参数

步骤1：打开微孔板读板仪开关，打开SoftMaxPro软件并点击ProtocolLibrary中CellGrowth&Viability文件夹中的CyQUANTFluorescenceprotocol。
步骤2：按表中所示参数设置仪器，此设置已在预配置的列表中。
步骤3：使用TemplateEditor设置孔板加样的模板，包括标准样品孔(每孔的细胞数)、空白对照孔(无细胞)和样品孔的位置。模板设置的列子如图1所示。注意，同时点击Ctrl和Shift键将显示每个孔的设置值，样品的名字(Un01-Un02)没有出现在所示图中。
步骤4：将微孔板放于读板机中，如果您的读板机顶读法需要放置适配器(如SpectraMaxM5)，请先放置适配器后再放入样品。
步骤5：点击软件的Read键，仪器将对微孔板进行读值，相关的荧光值(RFUs)将出现在软件的孔板位置。

数据分析

步骤1：如果设置了模板，微孔板读值后，在Grouptable里将会自动出现计算后的结果。
步骤2：TemplateEditor里设置了标准曲线组的话，标准曲线将会有软件自动生成。在CurveFit下拉菜单里可以选择拟合曲线公式，本应用说明的标准曲线选择的是log-log曲线拟合(图2)。也可以用quadratic曲线。
步骤3：计算实验样品每孔的细胞个数。软件通过标准曲线公式计算出每个实验样品的浓度，并显示在Unknownsgroup部分。

基于细胞的标准曲线结果

基于细胞的标准曲线如前文所述，呈现在图2中。在生成标准曲线时采用了log-log拟合算法，图中所示结果是SpectraMaxM5微孔板读板机得到的，MolecularDevices公司的其他具有荧光功能的读板机均可得到相似结果(数据未显示)。

表3为表1中所列出的CHO-K1细胞样品培养两天的增殖数据结果，培养第二天的细胞增殖结果由SoftMaxPro软件用基于细胞的标准曲线计算得出。

RNA酶处理、基于DNA含量做标准曲线的CyQUANT实验法

细胞增殖同样可以用DNA含量来评价并作出标准曲线。根据细胞曲线可计算出DNA含量，细胞裂解液经过RNA酶处理就排除了RNA对结果的干扰。在本应用说明中，列出了用DNA含量做标准曲线来定量细胞样品的设置步骤。

准备试剂

步骤1：制备1X细胞裂解液，用蒸馏水以1:20稀释细胞裂解液储存液，需制备每孔200μL。一部分细胞裂解液加入1mMEDTA和180mMNaCl，一部分不加EDTA和NaCl。
步骤2：制备1X和2XCyQUANTGR染液/细胞裂解液，用1X细胞裂解液以1:400或1:200稀释CyQUANTGR染液储存液。稀释液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。

在塑料管中制备DNA标准样品

步骤1：用1X细胞裂解液稀释试剂盒中100μg/mLDNA标准样品，稀释成1μg/mL存储液。
步骤2：将DNA存储液按表4所列按梯度稀释。
注意：CyQUANT试剂盒中的是λ噬菌体DNA，本文中的数据都是按标准梯度稀释。对于自己的实验也可选择其他来源的DNA样品，具体操作请参考产品说明书MP-7026。

准备细胞

依据所用的细胞系(贴壁还是不贴壁)，按照Life Technologies的CyQUANT说明书选择适当的细胞培养(微孔板中还是培养皿中)和冻存方法，在-70℃冻存细胞。本文中，贴壁细胞要先从培养皿中消化下来，然后离心，并将离心得到的细胞斑块冻存。

准备细胞样品、标准曲线DNA样品和空白

步骤1：将之前冷冻的离出细胞放在室温几分钟解冻。加入1mLCyQUANTGR染液/细胞裂解液，涡旋使细胞重悬。
步骤2：预处理细胞，每孔中加入含1mMEDTA和180mMNaCl的细胞裂解液，并在4个没有细胞的孔中加入同样的细胞裂解液(空白对照孔)。如果样品为之前冷冻的细胞离心斑块，先用100μL裂解液重悬，然后转移到微孔板中。在有细胞的样品孔和空白对照孔中分别加入4μLRNA酶(每孔两个单位，详见下文)。室温孵育1小时。
注意：无DNA酶的RNA酶处理细胞时浓度不超过10μL中含有饱和活性单位。例如，试剂盒中混合RNA酶浓度为500U/mL，所以每4μL中含有两个活性单位。
步骤3：在有细胞的样品孔和空白对照孔中分别加入100μL2XCyQUANTGR染液/细胞裂解液。
步骤4：将之前准备的DNA梯度稀释液依次加入到微孔板中，孔板中因包含两种对照，一种是加入稀释液但无DNA的空白对照，另一种是只含有1XCyQUANTGR染液/细胞裂解液的孔板空白对照(无DNA和RNA酶)。
步骤5：室温孵育2-5分钟

设置仪器和软件参数

步骤1：打开微孔板读板仪开关，打开SoftMaxPro软件并点击ProtocolLibrary中CellGrowth&Viability文件夹中的CyQUANTFluorescenceprotocol。
步骤2：按表2中所示参数设置仪器，此设置已在预配置的列表中。
步骤3：使用TemplateEditor设置孔板加样的模板，包括标准样品孔、孔板空白对照孔和样品孔(RNA酶处理的细胞)的位置。

读板和数据分析

步骤1：将微孔板放于读板机中。
步骤2：点击软件的Read键。
步骤3：仪器将对微孔板进行读值后，相关的荧光值(RFUs)将出现在软件的孔板位置，数据将依据设置分析出结果，并显示在Grouptables中。
步骤4：TemplateEditor里设置了标准曲线组的话，DNA标准曲线将会有软件自动生成。
步骤5：在CurveFit下拉菜单里可以选择拟合曲线公式，本应用说明的标准曲线选择的是log-log曲线拟合。
步骤6：软件通过标准曲线公式计算出每个DNA样品的浓度，并显示在Unknownsgroup部分。

DNA标准曲线结果

基于细胞的标准曲线如前文所述，呈现在图3中。在生成标准曲线时采用了log-log拟合算法，图中所示结果是SpectraMaxM5微孔板读板机得到的，MolecularDevices公司的其他具有荧光功能的读板机均可得到相似结果(数据未显示)。用RNA酶处理细胞检测DNA含量做标准曲线的例子现实在表5中。在此应用说明中，一个系列的细胞浓度被计算。事实上，每孔细胞个数在50-50,000个之间(标准曲线范围内)均可用此方法计算得到细胞DNA浓度。

图4显示横坐标为每孔细胞个数，纵坐标为平均DNA含量，曲线范围为50-50,000个细胞，结果如试剂盒说明书所述。图5中显示了RNA酶处理的和未处理的细胞样品RFUs值的比较，说明RNA酶处理会降低细胞裂解液的荧光强度。

总结

CyQUANT细胞增殖实验是快速的、灵敏的检测细胞个数和细胞DNA含量的荧光方法。SpectraMax M5微孔板读板机得到的数据结果与Molecular Devices公司的其他具有荧光功能的读板机得到的结果相似。基于细胞的标准曲线和5分钟的孵育，我们得到了与CyQUANT试剂盒相似的动态范围(50-50,000个细胞)。应用λ DNA样品得到的曲线及通过标准曲线计算DNA含量的下限位50个细胞。结合应用SoftMaxPro的软件分析功能及预置的CyQUANT拍摄设置，提供了一个计算和得到数据便捷的方法。

参考文献

1. Life Technologies Product InformationsheetMP 7026 1/12/01: CyQUANT CellProliferation Assay Kit (C-7026).