LAL检测的工作原理及在细菌检测领域的应用
2025-11-04 来源:本站 点击次数:49尽管目前有多种方法可用于检测细菌内毒素的存在，但鲎变形细胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）检测仍是金标准。鲎（Limulus polyphemus）不仅外形奇特（见图 1），而且的确来自另一个时代——距今 4.5 亿年前！它当之无愧地被称为“活化石”。
图 1：鲎（Limulus polyphemus）医学界对鲎血的兴趣主要源于其中存在的变形细胞（amebocytes）。这些细胞在鲎的生存中至关重要，是其抵御真菌和革兰氏阴性细菌的先天免疫关键。变形细胞内含有一种名为凝固原（coagulogen）的凝血因子。当它们接触到存在于入侵细菌细胞壁中的细菌内毒素时，凝固原会被释放并触发一系列酶促反应，最终导致凝固（凝块或胶化）、固定并中和病原体。凝血反应的起始点是凝血因子 C¹。这一特性可被用于检测需符合特定安全标准的注射类（静脉给药）药物。
LAL检测的工作原理
变形细胞在检测到细菌内毒素时产生可见反应的能力，是 LAL 检测的基础。LAL 检测基于从鲎血中分离出的变形细胞裂解物（LAL）提取物¹。LAL 检测主要有三种基本方法：凝胶凝块法、显色法和浊度法。
01 凝胶凝块法
凝胶凝块法是最初期且最简单的 LAL 检测方法。这是一种定性检测，通过肉眼观察样品管底部是否形成凝块或凝胶来判断样品中是否存在内毒素。
02 显色法
显色 LAL 检测是一种定量检测，其原理是：当样品中的细菌内毒素激活鲎凝血因子 C 时，会触发酶促反应，产生黄色（显色）（见图 2）。在试剂盒的特定检测范围内，颜色的强度与样品中污染物的含量成正比——内毒素越多，溶液的黄色越深。显色反应可通过分光光度计或酶标仪检测吸光度进行定量（通常以 EU/mL 或 EU/样品表示）。
图 2：显色 LAL 检测的酶促级联反应。鲎凝血因子 C 是反应的起点，最终产生黄色。显色 LAL 检测的动力学变体通过测量在加入底物后显色反应开始的时间，并基于标准曲线插值来计算未知样品的内毒素含量（见图 3）。
图 3：动力学显色 LAL 检测的信号曲线尤其在使用酶标仪进行定量时，显色 LAL 检测的优势包括可提高效率和检测通量，并且便于自动化。
03 浊度法
当样品本身带有颜色，可能干扰显色 LAL 检测的黄色读数时，通常会使用 LAL 浊度法。在这种情况下，利用 LAL 凝血产生颗粒，使溶液变得浑浊，然后检测其浊度。这种方法的检测结果不会受样品本身颜色影响。
在酶标仪上进行LAL测试
显色法和浊度 LAL 测试均可使用酶标仪进行定量。这些方法非常简单，只需使用吸收光酶标仪在 405-410 nm 波长下探测发色 LAL 反应的黄色出现，或在 340 nm 波长下探测 LAL 透射比浊法测定法的浊度变化。
所有配备吸收功能的 BMG LABTECH 酶标仪均可读取 LAL 测定结果。这些酶标仪包括 SPECTROstar Nano、Omega 系列、VANTAstar、CLARIOstar Plus 和 PHERAstar FSX。
MARS 数据分析软件也可用于进行动力学计算。对于此测试，比较每个样品达到特定 OD 阈值所需的时间非常重要，该时间用于比较已知浓度的样品，并创建用于计算未知值的标准曲线。
应用说明“Lonza 使用 BMG LABTECH 酶标仪和 MARS 数据分析进行内毒素探测的动力学试剂盒”提供了在酶标仪上运行显色 LAL 检测的示例。（点击“阅读原文”可在官网获取）
LAL检测与动物福利
不幸的是，LAL 的生产依赖于一种相对粗放的方式——捕捉鲎（2015 年超过 50 万只），以采集少量血液（见图 4）。虽然采血后鲎可以被释放，但已知仍有约 10–30% 在运输和/或采血过程中死亡。
图 4：在采血设施中被采血的鲎²LAL替代方案
来自新加坡鲎的重组凝血因子 C 蛋白（rFC）已被克隆，作为潜在的“合成”LAL 替代品³。对 rFC 底物 B 因子的切割位点的了解，使得基于重组蛋白的检测（称为 rFC 检测）得以开发。rFC 检测的前景较好，因为它比 LAL 更敏感，且对内毒素的特异性更高²。
另一种替代方法是单核细胞活化试验（MAT），这是一种体外细胞检测方法，通过检测单核细胞在内毒素驱动下释放的细胞因子来判断内毒素存在，通常结合 ELISA 检测，原理基于单核细胞对病原体的先天免疫反应。
References
- Iwanaga S. Biochemical principle of Limulus test for detecting bacterial endotoxins. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2007 May;83(4):110-9. doi: 10.2183/pjab.83.110. PMID: 24019589; PMCID: PMC3756735.
- Maloney T, Phelan R, Simmons N (2018) Saving the horseshoe crab: A synthetic alternative to horseshoe crab blood for endotoxin detection. PLOS Biology 16(10): e2006607.
- Ding JL, Navas MA 3rd, Ho B. Molecular cloning and sequence analysis of factor C cDNA from the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda. Mol Mar Biol Biotechnol. 1995 Mar;4(1):90-103. PMID: 7538401.
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