虾肝肠胞虫（EHP）核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）

◆ 产品说明 

动物病害检测系列可针对水样、饵料、活禽、水生动物及相关加工品等样品中病原生物体的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于对虾肝肠胞虫（EHP）的检测，检出限为10³copies/μL基因组DNA。

• 产品组成（96测试）

• 适用仪器

ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。

• 自备耗材和仪器

①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

   1）第一区：样本制备区。

 2）第二区：模板添加区。

   3）第三区：扩增及产物分析区。

   ★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

◆ 样品处理

①样品的采集和制备是虾肝肠胞虫检测的重要步骤，为防止交叉污染，应使用一次性消耗品，研钵应经160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高压处理的器皿应使用1%次氯酸钠溶液浸泡。②取样应尽量采取肝胰腺组织，对于同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取DNA。③采样过程应快速完成，将采取的样品放入无菌均质袋中均质成糜状，充分混匀。

• 实验操作

1.模板制备（样本制备区）

请参照水生动物病害基因组DNA快速提取试剂盒说明书的提取步骤。

2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）

剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-EHP-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。

4. 扩增反应（扩增及产物分析区）

使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。

按下列条件设置扩增反应：

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

• 结果判定

检测样品无Ct值或≥40，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有EHP或含量低于检出限；

检测样品Ct≤36，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有EHP；

检测样品36<Ct≤40，需进行一次重复实验，若Ct值仍处于36和40之间且呈“S”型扩增曲线，同时阴性对照无Ct值，报告样品阳性，否则报告样品阴性。

• NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
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